细胞生物学实验方法在创面修复研究中的应用

姜 艳 卓臣义 岑小宁 唐 强 唐习强 韦 骋 唐乾利

作者单位： 530004 广西 南宁， 广西大学医学院科学实验中心／右江民族医学院科学实验中心（姜艳）； 533000 广西 百色，右江民族医学院／桂西高发病防治重点实验室（卓臣义， 岑小宁， 唐强， 唐习强， 韦骋， 唐乾利）

中医学认为， 慢性难愈合创面属于“溃疡”范畴， 可由一种或多种因素诱发， 具有治愈困难、发病率高、 治疗费用高昂等特点。 流行病学研究资料显示， 慢性难愈合创面的发病率为1% ～2%［1］，且以糖尿病足、 压疮、 下肢静脉性溃疡最为常见，已成为临床研究的热点及难点。 笔者认为， 应用科学合理的实验方法探究慢性难愈合创面修复的细胞生物学作用机制对提高慢性难愈合创面的防治效果具有重要意义， 遂于本研究中对细胞生物学实验方法在创面修复研究中的应用进行了综述， 以期为慢性难愈合创面的临床治疗提供参考。

1 创面修复及细胞生物学概述

1.1 创面修复概述

创面修复是指皮肤组织损伤后通过自身组织再生、 重建或人为干预而愈合的过程［2］。 创面修复过程复杂、 连续且受全身反应调节， 不仅关系到局部创面， 同时也与身体整体机能息息相关。 目前， 相关研究证实， 创面修复主要包含炎症期、 增生期、组织重建期3 个阶段， 涉及多种特定细胞的行为、形态、 功能等生物学变化， 如炎症期主要为血液凝固及炎症细胞迁移， 增生期主要为角质细胞、 纤维母细胞和内皮细胞的迁移、 增殖、 分化以促进新生血管、 肉芽组织形成及创面再上皮化， 组织重建期主要为细胞外基质的成熟及组织结构和功能的恢复［3］。

1.2 细胞生物学概述

细胞生物学是以细胞为研究对象， 在显微、 亚显微和分子水平研究细胞结构、 功能， 分析细胞间的相互作用以及各种干预手段对细胞的作用机制，从而了解生物体的生长、 发育、 分化、 繁殖、 运动、 遗传、 变异、 衰老、 病变和死亡等生命规律的科学。 近年来， 细胞生物学发展迅速， 与分子生物学、 神经生物学和生态学并列为生命科学的四大基础学科。 细胞生物学实验方法包括细胞形态与结构观察、 细胞化学分析、 细胞生理学、 细胞工程等30 多种， 适用于医学基础研究的各个领域， 特别是细胞生物学具有研究对象专一性、 影响因素可控性、 实验内容独特性等特点， 结合创面修复特征，通过细胞生物学实验方法研究创面组织细胞的行为、 功能、 形态等特性， 可为创面修复的相关研究提供数据支持。

2 细胞生物学实验在创面修复研究中的应用

2.1 实验细胞

创面修复炎症期巨噬细胞、 中性粒细胞、 淋巴细胞等多种细胞参与了创面坏死组织及炎症细胞的清除， 增生期血管内皮细胞、 成纤维细胞、 上皮细胞、 表皮细胞等参与了新生血管的形成及创面的收缩和再上皮化， 重塑期成纤维细胞、 上皮细胞等参与了组织结构及功能的稳定［1］。 在细胞生物学实验中， 可采用创面修复过程中所涉及的各类细胞的原代培养细胞株或连续传代培养细胞株进行实验研究。

2.1.1 原代细胞 原代细胞是从机体取出后分散成单细胞进行培养的细胞， 因其离体时间较短， 故遗传性状和体内细胞相近， 可用于细胞形态、 功能和增殖分化的研究， 如可采用原代培养的角质形成细胞［3］、 成纤维细胞［4-5］、 上皮细胞、 血管内皮细胞［6］研究创面修复增生期的部分作用机制。

2.1.2 传代细胞 因原代细胞培养过程繁琐、 细胞状态多变、 实验成本较高及易发生生长停滞、 细胞衰老死亡等特点， 实际操作中多选择传代细胞进行研究，如可用于创面修复、 角质形成细胞上皮细胞间充质转化（epithelial-mesenchymal transition， EMT） 研究的人永生化表皮细胞系HaCaT 细胞［7］具有与正常人角质形成细胞同等的分化特性， 可繁殖150 代以上，且不具有肿瘤特性； 人成纤维细胞系HFF、 MSU-1.1细胞可用于细胞纤维化及其产物变化的研究［6］； 小鼠胚胎成纤维细胞系BalB／3T3 和NIH／3T3 细胞可用于细胞纤维化及基因转染与基因表达的研究［8］。

2.2 实验方法

2.2.1 细胞生物学行为研究 细胞具有增殖、 凋亡、 迁移等多种行为， 均可用于创面的细胞实验研究， 如创面修复炎症期中性粒细胞、 巨噬细胞向受损部位迁移； 增生期成纤维细胞大量增殖、 合成并分泌胶原纤维和基质成分， 与新生毛细血管共同形成肉芽组织， 填补缺损创面［9］， 此过程中若成纤维细胞过度增殖， 可形成浅表性瘢痕、 增生性瘢痕甚至瘢痕疙瘩［10］。 可通过特定蛋白检测、 细胞代谢活性及ATP 含量检测、 活细胞荧光标记等方法研究细胞的增殖情况， 通过细胞划痕实验［11］、 Transwell 实验［12］、 实时细胞追踪实验等研究创面修复过程中内皮细胞、 表皮细胞的迁移行为。

2.2.2 细胞生物学形态研究 越来越多的实验证实， 创面细胞表型的改变可影响细胞的增殖， 进而影响创面修复［13］， 如炎症期巨噬细胞发生极化，细胞表型可变为具有促炎特性的M1 型， 以及具有抑炎特性的M2 型， 两者作用截然相反， 通过两者含量比例控制创面的炎症走向［14］； 创面重塑期成纤维细胞可通过转化为肌成纤维细胞表型而影响组织的致密性和创面的收缩性［15］， 导致瘢痕的形成。 通过药物刺激、 荧光标记、 基因干扰、 激光扫描、 透射电镜扫描、 免疫组化等多种实验方法观察创面相关细胞的形态、 表型、 结构等， 以预测创面的发展方向［16-17］。

3 细胞生物学实验示例

近年来， 皮肤再生医疗技术（moist exposed burn therapy／moist exposed burn ointment， MEBT／MEBO）被广泛应用于慢性难愈合创面的治疗， 且唐乾利等研究学者对其进行了多项综合临床与基础实验研究， 结果证实其可改善表皮细胞超微结构， 影响细胞增殖和迁移［18-19］， 并可促进内皮细胞生长， 调控血管新生等［20-24］， 因此， 可以MEBT／MEBO为例探讨细胞生物学实验的具体应用。 如为研究MEBT／MEBO 对表皮细胞增殖与迁移行为的影响， 可通过细胞划痕实验观察MEBO 作用后的人永生化表皮细胞系HaCaT 细胞或原代成纤维细胞的变化情况； 为明确MEBT／MEBO 对细胞纤维化的影响， 可通过实验检测MEBO 干预后的成纤维细胞系HFF 细胞的纤维化产物变化情况。

4 小结与展望

细胞生物学实验可通过细胞形态、 结构与功能等的研究探索创面修复规律， 且细胞生物学实验方法较多， 不仅能够研究创面修复过程中表皮细胞增殖、 分化等的生物学行为， 而且还可通过不同信号通路及其交互作用研究某种药物或技术在创面修复过程中的分子生物学作用机制， 为部分医疗技术的临床应用提供理论依据。