Hippo通路在原发性肝癌发生发展中的作用

洪莹晖， 王 纯， 叶明亮， 罗 杰， 刘佳良， 任 超， 蓝偲瑜， 赵 秋， 常 莹

武汉大学中南医院 消化内科， 湖北省肠病医学临床研究中心，肠病湖北省重点实验室， 武汉 430071

原发性肝癌的发生是多因素、多步骤的复杂过程，病毒感染、酒精、黄曲霉素、代谢综合征等基础疾病都能增加原发性肝癌的患病风险[1]。然而其具体的病理机制尚待完善。通常所说的肝癌“三部曲”即：肝纤维化—肝硬化—肝癌，在原发性肝癌的发生发展过程中，肝组织硬度是不断增高的，硬度作为机械信号的一种，被证实在调控细胞增殖和器官的发育方面有重要作用，也是癌症的重要“催化剂”[2]。同时，临床上有部分患者的原发性肝癌缺乏肝硬化病理基础，这其中的机制尚需深究。部分原发性肝癌的形成和发展过程中既有肝组织硬度的不断增加，同时也有肝癌细胞在应对逐渐硬化的组织微环境的病态响应过程。细胞一直感受着外界施加的力，并通过调整细胞内的关键信号通路和分子的表达来适应这些变化并生存下来，可以说原发性肝癌在硬度中“孕育”，同时也在硬度中不断“成熟”—获得更强的“本领”如侵袭转移，这一癌症的特有表征，是晚期患者丧失肝移植手术治疗机会的主要原因。

1 经典Hippo通路

Hippo信号通路是细胞机械转导的经典途径，由一系列的激酶组成，在促进细胞增殖、侵袭和迁移等方面具有重要作用，已有文献[3]报道Hippo信号通路能够促进包括癌症在内的各种疾病的发生发展。Hippo信号通路主要是由哺乳动物Ste20样激酶1/2(MST1/2)、大肿瘤抑制基因1/2(LATS1/2)，YAP蛋白和(或)其旁系同源TAZ(也被称为WW结构域，包含转录调节因子1)构成[4]。Hippo途径可以被多种异常信号激活，当Hippo处于“活性”状态时，MST1/2被磷酸化后活化LATS1/2，继而磷酸化YAP/TAZ，从而使其失活被抑制，滞留在细胞质中[5]。相反，当激酶处于失活状态时，YAP/TAZ去磷酸化易位至细胞核继而启动下游基因的转录[6]。

YAP蛋白是Hippo通路的下游核效应器，Hippo通路可以通过抑制转录共激活因子Yki，或其同源类似物YAP/TAZ影响细胞的基因型。YAP作为Hippo信号通路的核效应器的上调元件，是多种实体肿瘤包括肝癌发生发展进程中的重要环节[7]。已有文献[8]报道，YAP/TAZ在肿瘤中的过度表达促进肿瘤的发生，并且被认为是大量实体癌症如肝癌的促癌基因。WW结构域是具有两个高度保守的色氨酸结构域，并有假设猜想其可调节蛋白质之间的相互作用，不同物种YAP中的WW结构域是保守的。据报道[9]，YAP1仅包含一个WW域，而YAP2由两个WW域组成。之前的研究[10]对于这些结合域进行了结合测定，并发现WW结构域可以与WBP-1和WBP-2的PPXY基序相关联。值得注意的是，YAP被鉴定为含有C末端转录激活域的转录共激活因子[11]。YAP C末端的四个氨基酸与蛋白质中的PDZ结构域相互作用，这可能在调节YAP的亚细胞定位中发挥重要作用[12]。最近的一项研究[13]表明，YAP-TEAD异二聚体可以与Taiman、GAGA、AP-1及β-catenin转录因子相互作用，并共同调控下游基因的表达。YAP蛋白Ser127位点上的磷酸化与14-3-3蛋白相结合，并通过细胞质螯合抑制其转录活性。磷酸酶，例如蛋白磷酸酶-1，可以使YAP Ser127脱磷酸化，从而促进YAP的核积累并增强其转录活性[14]。酪蛋白激酶1可以诱导YAP Ser381位点上的磷酸化并影响其稳定性，随后激活磷酸化的降解基序[15]。促生长基因Myc、CycE、E2F1和细胞凋亡的抑制基因Diap1和BIRC3有助于YAP蛋白的活化和积累[16]。Wnt、Notch、EGFR、TGFβ和JAK-STAT信号通路的配体也已被确定为YAP蛋白的靶标，可以影响组织生长[16]。此外，据报道[9]，Hippo途径的一组上游成分包括Merlin、Ex、Kibra、AMOTL2和LATS激酶在负调节YAP蛋白中起着至关重要的作用。

2 Hippo/YAP信号转导通路的失调是肝癌的早期参与者

在多种实体肿瘤中包括原发性肝癌、肺癌、乳腺癌等均发现了YAP的异常过度表达[17-18]。同时，YAP被列为确定原发性肝癌进展的临床标志物。YAP的水平和肝癌患者的Gleason评分、血清AFP水平及侵袭转移的发生风险指数呈正相关[19]。目前YAP的过度激活如何驱动肝癌的发生和发展机制尚不完善，但是近期研究报道涉及以下两种机制。

2.1 过度激活的YAP参与早期肝星状细胞活化 肝纤维化是由于慢性持续的肝损伤信号导致的肝细胞死亡和再生重叠交织的肝组织进行性改变[20]。慢性肝损伤已成为全球负担，尽管在丙型肝炎、肥胖和代谢综合征等引起的慢性肝脏疾病治疗方面取得了较大进展，但是在抗纤维化治疗方面仍然存在很多困难[21]。肝星状细胞是细胞外基质过量沉积的主要来源，持续的细胞外基质的胶原沉积导致肝脏硬度的持续变化[22]。Dupont等[23]发现在早期纤维化反应期间，核效应因子YAP作为机械信号转导的中间介质响应细胞外机械信号，促进细胞存活、增殖和细胞外基质的沉积。Mannaerts等[24]在纤维化的体外模型中发现，YAP很早就已经被过度激活并转移至细胞核中，激活下游转录因子TEAD1-4的表达；同时，体内实验证明，YAP对于早期肝星状细胞的活化和沉默YAP带来的抑制肝星状细胞活化的药理作用具有重要意义。细胞外基质的积累促进肝星状细胞的活化，而活化的肝星状细胞导致的细胞外基质的硬化进一步促进YAP的活化，由此在YAP-细胞外基质-肝星状细胞之间形成的反馈通路，带来级联放大反应，最终导致了肝脏的不可逆损伤乃至肝癌的发生[23]。

2.2 YAP/TAZ促进肝炎的发生和维持 肝纤维化主要是由于肝脏的慢性炎症而引起，Kim等[25]发现在Mst1/2基因缺失的肝细胞中，单核细胞趋化蛋白(monocyte chemoattractant protein-1，MCP1)的表达高度上调，同时巨噬细胞大量浸润，而沉默YAP1则大大削弱了MCP1诱导肝脏炎症和肝癌的形成；这一点也在Mst1/2敲除的小鼠体内得到证实。同时，文献[26]报道了在原发性肝癌中TAZ的表达和促肿瘤炎症细胞因子IL-6的分泌密切相关，而IL-6/STAT3信号传导通路同时是慢性肝损伤的主要促炎因素之一。YAP/TAZ与肝纤维化的形成密切相关，并且是肝纤维化乃至肝癌的有力促进剂。

3 Hippo通路与其他转导通路的串扰

3.1 TGFβ信号转导通路 TGFβ信号转导通路作为一把“双刃剑”，在机体正常生长、发育中参与细胞的增殖、分化、迁移和凋亡，发挥着重要的抑癌作用，而在癌症形成之后的进展期中成为癌细胞重要的“助推剂”之一。尤其癌症的晚期阶段，在诱导癌细胞的上皮-间质转换和肿瘤的侵袭迁移中发挥重要作用。TGFβ在肝癌中显著高表达，且表达水平与疾病的进展、预后不良相关[27]。在肝脏疾病进展的不同阶段，TGFβ信号转导通路扮演的角色不同。TGFβ抑制恶变前肝细胞的紊乱增殖，在肝癌形成之后，它促进细胞外基质积聚和肿瘤的侵袭迁移。Hippo通路和TGFβ通路串扰的首次发现是关于YAP和Smad7的结合，从而抑制TGFβ通路的一部分信号转导[28]。随着纤维化程度的加深，在TGFβ靶基因增加的同时伴随着Smad6/7的显著降低。Smad7作为重要的TGFβ抑制因子在TGFβ通路活化之后的显著降低可能与YAP的细胞质定位有关。同时，YAP/TAZ缺乏的成纤维细胞在体外对于TGFβ刺激的反应性明显降低，其产生细胞外基质明显减少[29]。此外，YAP/TAZ还与多种其他的Smad蛋白结合，感受不同的调节因素通过不同的机制参与TGFβ的信号调控。YAP/TAZ调节Smad蛋白的亚细胞定位对于TGFβ通路功能的发挥必不可少，YAP/TAZ的磷酸化可以促进Smad2/3的核积聚而激活下游通路[30]。

3.2 Wnt/β-catenin信号转导通路 Wnt信号转导通路包括CTNNβ1依赖性的经典途径和不依赖CTNNβ1的非经典途径。早在1988年就发现Wnt信号通路的异常表达是肝癌发生过程中的早期事件并且与肝癌的侵袭迁移有关，其中非经典途径发挥的作用尚不明确[31]。经典途径的Wnt信号被激活后，细胞质中的β-catenin积聚后易位至细胞核，在细胞核中，其与TCF/LEF转录因子、Pygo和转录共激活因子BCL-9/BCL9l形成转录激活复合体，促进下游基因的表达。Kim等[25]发现在albumin-Cre(Alb-Cre)Mst1-/-Mst2fl/fl突变体(以下简称DKO)小鼠肝脏中，Hippo信号通路中关键激酶MST1/MST2的缺失导致了肝细胞中经典Wnt/β-catenin信号转导通路的激活。同时，在DKO小鼠中，β-catenin和YAP/TAZ之间的关联在调控肝脏的大小和肝癌的发生发展中发挥重要作用。在双杂交的β-catenin敲除的DKO小鼠中，与对照组相比，实验组的小鼠YAP/TAZ蛋白水平明显降低，同时其肿瘤负荷和肿瘤数目也明显较少。此外，YAP/TAZ还通过调节细胞质中Dishevelled(Dvl)的磷酸化以及β-catenin的细胞质定位来抑制Wnt /β-catenin的活性[16]。

4 microRNAs(miRNAs)对于Hippo/YAP通路的调控

miRNAs作为一类21～25个核苷酸的高度保守的非编码小核苷酸，主要通过识别靶基因的3′-UTR特定互补序列来降解或者抑制靶mRNA[32]。miRNAs几乎参与了机体各种生理和病理过程，包括肝癌在内的多种癌症的发生发展。研究[33]发现miR-375通过靶向YAP1负向调控肝癌的发展。关于miRNAs调控LATS1的报道较少，可能是因为LATS3′-UTR的长度明显短于LATS2，因此LATS1不易被miRNAs靶向调控。miR-103直接抑制LATS2的活性使Hippo途径失活而促进肝癌的侵袭迁移[34]。在肝癌细胞系HepG2和Hep3B中，miR-186通过靶向YAP1抑制癌细胞的增殖、迁移和侵袭[35]。此外，HBV编码的反式激活因子preS2的过表达通过抑制miR-338-3p上调TAZ从而促进肝癌的增殖和迁移[36]。miR-29c-3p通过调控Hippo通路中的重要激酶LATS1的甲基化抑制肝癌的发展而成为可能的临床治疗靶点[37]。miRNAs影响Hippo通路中的重要激酶的激活/失活过程和核效应器YAP的表达，从而广泛参与到Hippo通路的调控当中。

5 Hippo通路参与肝癌的药物抵抗和侵袭转移

索拉非尼作为治疗肝癌的靶向药物，其治疗的晚期肝癌患者的中位生存期仅为12.4个月，美国食品药品监督管理局批准上市的乐伐替尼治疗肝癌患者的中位生存期仅为13.6个月[38-39]。目前对于索拉非尼很多患者已经出现耐药，尽管其中具体的耐药机制尚未完全明确，但是耐药的产生通常涉及药物扩散和进入细胞的速率减慢以及细胞对于药物敏感性的降低这两个方面。已有文献[19]报道在肝癌细胞株Huh-7中YAP的过表达明显降低了索拉非尼对于细胞的生长抑制作用，同时si-YAP组的裸鼠肿瘤重量明显低于对照组。此外，在肝癌中机械信号的转导增加为促进YAP入核的主要因素，研究[40]发现YAP通过RAC1-ROS-mTOR途径抑制自噬相关的癌细胞死亡，从而促进肝癌细胞株BEL-7402的多重耐药性，且抑制YAP的Verteporfin(VP)联用5-Fu实验组的裸鼠肿瘤重量和肿瘤负荷显著低于仅给予5-Fu的对照组。在肝癌中，YAP通过促进细胞外基质的积聚影响药物的扩散速率和降低细胞对化疗及靶向药物的敏感性，进而促进耐药的发展，给临床治疗造成了阻碍[20]。

6 总结

原发性肝癌作为最常见的恶性肿瘤之一备受关注。肝硬化基础之上发展的原发性肝癌肝组织中，硬度作为一种物理信号变化尤为显著。Hippo通路是重要的细胞外机械信号转导通路，在果蝇和哺乳动物中高度保守。Hippo通路失调是原发性肝癌的早期事件，和TGFβ、Wnt等信号通路的串扰促进肝癌的发展。YAP作为Hippo通路的核效应器是原发性肝癌的预后标志物，促进肝癌耐药。探究原发性肝癌中Hippo通路的作用机制，对于寻找新的原发性肝癌的治疗方法具有重要意义。