循环肿瘤DNA在食管癌患者中的研究进展 *

殷文明，蒋敬庭，吴昌平

(苏州大学附属第三医院肿瘤生物诊疗中心，江苏省肿瘤免疫治疗工程技术研究中心，苏州大学细胞治疗研究院，江苏常州213003)

食管癌患者早期症状不明显，治疗预后差，总体5年生存率仅为15%～25%[1]。传统的影像学技术和肿瘤标志物检测在食管癌的早期诊断、治疗后随访及病情评估方面存在诸多局限。循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)检测取材方便，灵敏度高，且能实时检测肿瘤转移及评估肿瘤进展，作为一种新型分子标志物近年来越来越受到人们关注[2-4]。研究发现，在胰腺癌、结直肠癌和膀胱癌等多种恶性肿瘤中ctDNA检出率高达75%[5]。本文就ctDNA在食管癌治疗领域的最新研究进展进行总结，旨为食管癌的精准诊疗提供新策略。

1 ctDNA及相关检测技术

1.1ctDNA 健康人外周血中存在游离DNA片段(cell-freeDNA，cfDNA)，而肿瘤患者体内的cfDNA含量明显高于健康人群，晚期肿瘤患者体内含量更多。这部分来源于肿瘤的cfDNA即为ctDNA。cfDNA在DNA释放过程中保留了核染色质的某些特征。肿瘤患者的cfDNA中含有各种与肿瘤基因突变相同的体细胞突变，如致癌基因和抑癌基因的突变、微卫星变化、启动子甲基化和杂合性缺失等。

cfDNA分子大小为500～30 000 bp，而ctDNA片段长度仅为150～200 bp[6]。ctDNA的半衰期在15 min至数小时不等，平均约2 h[7]。ctDNA来源于肿瘤细胞的坏死及凋亡；血液循环或微转移灶中肿瘤细胞的溶解释放；肿瘤细胞主动释放DNA进入血液循环；血液中的DNA酶抑制剂抑制血浆DNA降解，使DNA在血液中富集等。多数研究认为，细胞的凋亡、坏死和分泌是ctDNA的主要来源。

1.2ctDNA检测方法 外周血中ctDNA数量较少，占cfDNA总数的0.01%～1%，需用高特异性、高灵敏性方法进行检测。主流的检测方法有数字聚合酶链式反应(digital PCR，dPCR)、突变扩增阻滞系统(amplified refractory mutation system，ARMS)、新一代测序法(next-generation sequencing，NGS)等[8]。ARMS和dPCR法检测灵敏度高，可绝对定量，缺点是仅能检测已知突变位点和基因重排。NGS法可进行全基因组的单核苷酸变异、拷贝数变异检测，基因重排和扩增，可检测未知突变。然而其敏感性和特异性受DNA聚合酶的错误率和测序反应的限制，并且检测耗时长。

ctDNA检测技术包含定量检测和定性检测。有学者研究发现，ctDNA浓度与患者体内肿瘤负荷大小呈正比，通过定量检测外周血ctDNA浓度，可根据浓度的高低来推测肿瘤情况。但凝血过程中淋巴细胞破裂释放DNA可影响循环DNA检出水平。定量分析时，血浆相对血清能更准确地反映机体循环DNA的真实水平，但血液必须在采集后1～4 h内离心分离[9]。

肿瘤的表观遗传变异类型包括DNA甲基化、基因拷贝数变化、单碱基突变、基因融合、原癌基因异常表达等[10]。ctDNA的定性分析即是对肿瘤特异性基因突变的检测。研究表明，在食管癌患者血浆中cfDNA的分布与相应肿瘤组织中检测到的DNA分布呈高度一致[11]。通过对ctDNA的监测能够检测到肿瘤患者组织和血浆中存在的特有突变，准确地对肿瘤进行分型，从而指导临床治疗。

2 ctDNA在食管癌患者中的应用

ctDNA的分析应用可贯穿于恶性肿瘤的整个诊治过程，如组织病理标本获取困难的肿瘤患者治疗策略的制定，治疗过程中监测治疗反应和识别耐药性突变的出现等。许多研究已证实，同时检测的血浆和组织样本之间关键位点的改变，其一致性高达80%～90%[12-14]。另有研究表明，食管癌患者携带的肿瘤相关单核苷酸变异、拷贝数改变及结构变异等遗传学改变，为食管癌的诊断、监测肿瘤负荷及治疗疗效、预测疾病复发及判断预后等提供了依据[15]。

2.1ctDNA在食管癌早期诊断中的应用 肿瘤早期发现是减少肿瘤相关死亡的关键环节之一。早期食管癌没有特异性临床症状，确诊时多处于中晚期。但ctDNA的异常在肿瘤发生的早期就可检测到。食管鳞癌患者血浆ctDNA水平显著高于健康人群，并且TNM分期为晚期以及发生淋巴结转移患者的血浆ctDNA水平显著高于TNM分期早期和未发生淋巴结转移的患者。

DNA甲基化是目前发现的在食管癌分子诊断中具有广泛应用前景的一种生物学标志物，并且与常规肿瘤标志物无相关性。研究表明，循环DNA中检测到的CASZ1、CDH13和ING2基因高甲基化可作为食管癌诊断的一种潜在的生物学标志物[11]。Fece等[16]研究了超过9 000个CpG位点的cfDNA甲基化评分后发现，cfDNA甲基化评分用于预测癌症类型的准确性可以达76.3%。这提示血浆游离DNA甲基化谱可作为潜在的生物学标志物应用于食管癌的诊断。

此外，微卫星改变也可以从食管鳞癌患者的血清标本中发现。例如Eisenberger等[17]检测了食管癌患者的肿瘤及血清中微卫星情况，并以健康个体作为对照，结果发现92.9%的食管鳞癌患者原发肿瘤中有1个或多个微卫星DNA改变，96.4%的患者血清中至少有1个微卫星DNA变化，而健康人对照者血清DNA中均未发现微卫星改变，提示血清微卫星DNA分析也是检测食管鳞癌的1个具有潜在临床应用价值的指标。

2.2ctDNA在食管癌治疗中的应用 早期食管癌仅需接受单纯的手术或放疗，而中晚期食管癌的标准治疗方案为同步放、化疗。最近一项研究表明，食管腺癌患者ctDNA数量和突变频率均随肿瘤分期增加而增加，并可在临床或影像学发现肿瘤进展前检测到ctDNA水平变化[18]。因此，对于临床分期为早期但伴有ctDNA数量或频率增加的患者给予更积极的治疗或可改善这部分患者的预后。

晚期转移性食管癌通常接受全身药物治疗。研究显示，上消化道肿瘤患者的不同转移病灶和原发肿瘤间的MET基因扩增具有显著的异质性[19]。单病灶活检的分子谱不足以指导靶向治疗药物的选择。ctDNA来源于全身肿瘤，能克服肿瘤区域异质性问题，较全面地反映肿瘤基因全貌。

Petty等[20]设计了一项多中心前瞻性双盲实验，发现吉非替尼治疗的EGFR扩增食管癌患者与安慰剂组相比其总体生存率显著提高，但在EGFR阴性食管癌患者中，吉非替尼组与安慰剂组相比总体生存率没有显著差异。相关研究证实，血浆ctDNA中EGFR的突变状态与相应的肿瘤组织相一致，提示可以使用血浆ctDNA替代组织来评估EGFR突变状态，筛选出适合接受吉非替尼治疗的患者[21]。

值得关注的是，食管鳞癌和食管腺癌在发病机制上显著不同，也具有明显不同的分子特征。食管鳞癌表现出频繁的CCND1、NOTCH1、SOX2和/或TP63的基因组扩增，而ERBB2、VEGF、AKRAS、GATA4和GATA6基因改变则在食管腺癌中更为常见[22-23]。应慎重对待文献中关于食管癌药物治疗的相关结论。

2.3ctDNA在评估食管癌患者预后及转移复发中的应用 早期发现对于复发后早期干预和延长患者生存非常重要。目前临床上采用的血液肿瘤标志物的阳性率低，难以及时发现肿瘤进展，而ctDNA可以作为肿瘤微小残留的潜在生物学标志物预测肿瘤患者预后。ctDNA异常升高意味着患者具有更高的复发风险。研究表明，晚期实体肿瘤患者血浆循环DNA的中位浓度可达健康志愿者的3倍以上，且浓度越高，总体存活率越低[24]。通过动态监测ctDNA可以先于影像学检查数周至数月发现肿瘤进展[25-26]。

通过检测ctDNA的肿瘤相关突变及甲基化也可以预判食管癌患者的预后。Ling等[27]采用实时甲基化特异性PCR(real-time MSP)对209例食管鳞癌患者的肿瘤组织样本和血浆样本MSH2基因启动子高甲基化进行分析，结果显示209例食管鳞癌患者中有101例组织样本发现异常MSH2甲基化，而其中77例的血浆DNA样本发生了相同的变化。随访数据显示，血浆DNA中MSH2高甲基化的食管鳞癌患者术后无病生存期(disease-free survival,DFS)明显低于MSH2非甲基化患者(RR=21.357,95%CI:8.448～55.279,P=0.000)。Pennathur等[28]通过回顾癌症基因组图谱项目数据以及食管癌分子分层和分类的进展，发现食管腺癌中的基因表达谱也与患者预后显著相关。以上研究提示，ctDNA甲基化状态无论对食管鳞癌还是食管腺癌都是具有临床应用价值的预测因子。

此外，血浆DNA中CCND1基因扩增的食管鳞癌患者复发频率明显升高，无复发生存时间较短，是判断复发的独立危险因素[29]。食管癌患者ERBB2基因扩增与患者存活率之间也存在显著关联，但仅有约7%的患者可以检测到ERBB2扩增[30]。联合检测多个基因组异常或可提高血浆DNA预测食管癌复发的效率。

3 小结及展望

液体活检成为近年来的研究热点。虽然循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)也可动态监测肿瘤状态，但CTCs有着极高的异质性并存在上皮-间质转化(EMT)等缺陷，尚未能在临床上广泛使用。ctDNA可先于影像学检查诊断早期肿瘤，并可在疾病过程中动态监测，且克服了肿瘤内异质性，提供更完整的信息。但ctDNA在食管癌的临床应用仍存在诸多挑战，如ctDNA检测的标准化、敏感性仍有欠缺，尤其对ctDNA水平较低者，同一血液样本采用不同测序方法的检测结果也存在差异。综上所述，作为非侵袭性诊断标志物，ctDNA在食管癌的早期诊断、治疗、预后评估以及个体化治疗等方面具有重要作用，随着分子标记研究的不断深入，ctDNA将为食管癌的诊治及预后改善提供新手段。