IL-27通过miR-935抑制非小细胞肺癌细胞增殖的体外初步试验

刘春齐，万小云，张耀森，江俊伟

(1.广州市番禺区中心医院，广东 广州 511300；2.广州市番禺区中医院，广东 广州 511300)

IL-27是一种细胞因子，已被报道是一种肿瘤抑制基因，在各种癌症中发挥着突出的作用，如抑制肿瘤生长、侵袭和转移，促进细胞死亡[1-3]。非小细胞肺癌(NSCLC)病例总数占全球肺癌病例数目的一半以上[4]。IL-27在NSCLC中发挥重要作用，可抑制NSCLC的发生，但机制尚不清楚。虽然NSCLC的手术技术成熟，但复发和转移率仍然很高，中位生存期不到1年，关于细胞因子在NSCLC中的作用有大量的报道[5]。IL-27抑制NSCLC细胞增殖并增加细胞凋亡[6-8]。IL-27不仅下调了与干细胞和上皮间质转化(EMT)相关的基因，而且在异种移植模型中，IL-27还能促使瘤内髓样细胞发挥抗肿瘤作用[9]。IL-27抑制血管内皮生长因子、配体8 (C-X-C motif)、配体5 (C-X-C motif)等促血管生成因子在NSCLC细胞中的表达[10-11]。miRNAs是非编码 RNA，大约有20个核苷酸，并且有结合目标基因的序列[12]。最近研究发现，miRNAs在NSCLC细胞增殖中发挥作用，证实了其重要的调节作用[13]。尽管报道了IL-27在NSCLC中的作用，但仍然缺乏对miRNA调节的研究。本研究旨在探讨IL-27是否能通过miR-935抑制NSCLC细胞增殖。结果表明，IL-27可能是通过抑制miR-935表达来治疗NSCLC一种潜在的方法。

1 资料与方法

1.1样本来源：广州市番禺区中心医院患者提供NSCLC样本。15例患者属于Ⅱ期，Ⅲ期33例，Ⅳ期30例。收集来自患有NSCLC的患者的血液样品，并使用血清检测IL-27或miR-935的表达。

1.2细胞培养：NSCLC细胞株(H1299,A549)和正常肺细胞(BEAS-2B)均购自美国ATCC，培养条件：GIBCO公司生产的DMEM培养基加HyClone公司生产的10%胎牛血清加双抗(北京索莱宝公司生产的1%青霉素链霉素混合液)，在含5% CO2的37℃恒温细胞培养箱中培养。

1.3方法

1.3.1实时荧光定量PCR：用Thermo Fisher Scientific公司生产的总RNA提取试剂盒分离细胞中总RNA，逆转录得到cDNA，再将得到的cDNA加入 PCR 反应体系中进行扩增，测定熔解曲线，记录CT值。并用2-ΔΔCt来确定miRNAs的表达的水平。该实验中所用引物购自华大基因 (中国深圳)。

1.3.2酶联免疫吸附试验：用美国Abcam公司生产的ELISA试剂盒测定NSCLC患者的血液样本或转染miR-935的NSCLC细胞，按厂家提供的ELISA方法和标准测定IL-27蛋白浓度。

表1 引物序列

1.3.3CCK-8细胞增殖实验：用Thermo Fisher Scientific公司生产的细胞增殖检测试剂盒用CCK-8法检测NSCLC细胞增殖情况。在96孔细胞培养板中铺2×103个细胞。按照说明书上指导的时间培养后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，细胞在养箱中温育2 h。用ELISA法在450 nm处测定吸光度值。

1.3.4MTT法检测细胞存活情况：①接种细胞：收集对数期细胞，用含10 %胎牛血清的DMEM培养基制成单细胞悬液，以每孔5 000个细胞的密度接种到 96 孔板中，每孔液体体积为 200 μl。②培养细胞：同一般培养条件，培养3 d(可根据试验目的和要求决定培养时间)。③呈色：培养3 d后，每孔加 MTT 溶液20 μl (用pH值=7.4的PBS配制为5 mg/ml)。细胞培养箱培养4 h，小心吸弃孔内培养上清液，用酶联免疫检测仪OD570 nm(630 nm校准)测量各孔的吸光值，绘制细胞生长曲线。

1.4统计学分析：所有分析均采用SPSS 20.0统计软件进行检测，P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1IL-27抑制NSCLC细胞生长：见图1。

A：NSCLC细胞和正常肺上皮细胞IL-27 mRNA水平；B：NSCLC细胞和正常肺上皮细胞IL-27蛋白水平；C和D：IL-27抑制H1299和A549细胞增殖图1 IL-27抑制NSCLC细胞增殖

研究IL-27在NSCLC细胞生长中的作用。用细胞和正常肺上皮细胞进行检测IL-27蛋白表达，培养NSCLC细胞，提取总RNA，检测NSCLC细胞和正常肺上皮细胞IL-27 mRNA水平，结果见图1 A。培养NSCLC细胞进行培养基收集，使用酶联免疫试剂盒检测NSCLC细胞和正常肺上皮细胞IL-27蛋白水平。见图1 B。结果表明，BEAS-2B中IL-27的mRNA和蛋白水平均高于A549和H1299 。用IL-27 (10 ng/ml)处理H1299和A549细胞，采用CCK-8法检测细胞，结果见图1C、图1D。结果表明，IL-27具有抑制H1299和A549细胞增殖的作用。

2.2miR-935靶向IL-27促进NSCLC细胞增殖：探讨IL-27在NSCLC细胞生长中的作用，用miR-935或10 ng/ml的IL-27处理H1299和A549细胞，然后用MTT法检测细胞存活情况。结果表明IL-27对H1299和A549细胞生长有抑制作用，miR-935逆转了由H1299和A549细胞中的IL-27的作用。见图2。

图2 miR-935靶向IL-27促进NSCLC细胞增殖

3 讨论

IL-27是癌症抑制因子，其miRNA调控机制尚不清楚。该研究发现，IL-27在NSCLC细胞中受miRNA调控。结果表明，IL-27具有抑制NSCLC细胞增殖的作用，miR-935调控了IL-27在NSCLC细胞中的表达。IL-27与miR-935的功能关系表明，miR-935的上调可直接调控IL-27表达，促进NSCLC细胞的增殖。

IL-27是一种多效双链细胞因子，由EBI3和IL-27p28亚基组成[2]。IL-27作为异二聚体受体起作用，主要由IL-27Rα(WSX1)和通过STAT1和STAT3的gp130链组成[14-15]。IL-27在癌症中通常起抑癌作用，IL-27是一种免疫增强细胞因子，其与IL-12协同作用，支持CD4+T增殖，T辅助细胞1型细胞分化和IFN-γ的产生[2，16]。

IL-27具有潜在的抗肿瘤活性，不仅与诱导肿瘤特异性T辅助细胞1型和细胞毒性T淋巴细胞反应有关，而且与肿瘤细胞增殖，存活和血管生成潜能的直接抑制作用有关[17]。在这项研究中，我们发现IL-27能抑制NSCLC细胞增殖。参与评估miRNA作用的研究显示，NSCLC中miRNA表达失调，并推测其对恶性肿瘤的重要作用。这些miRNA既可以作为致癌基因，也可以作为肿瘤抑制因子。观察到miR-10a，miR-200，miR-224，miR-410，miR-27a和miR-320的在NSCLC中表达下调，并且miRNA可以抑制细胞生长。

通过miRNA芯片检测膀胱癌组织中miR-935上调。上调miR-935通过靶向INPP4A促进胰腺癌PANC-1细胞的增殖[18]。miR-935通过靶向SOX7促进肝癌和胃癌细胞增殖[19]。然而，miR-935通过靶向胃印戒细胞癌中的Notch1抑制细胞增殖[20]。报道的数据表明，miR-935在癌症中具有双重作用，取决于癌症的起源。在本研究中发现miR-935在NSCLC细胞和组织中升高。miR-935通过靶向IL-27表达促进NSCLC细胞增殖。

总之，通过靶向IL-27，MIR935在NSCLC中发挥致瘤性小RNA的作用。抑制miR-935是一种可能的治疗方法。希望IL-27和抑制miR-935的联合应用是今后治疗NSCLC的一种好方法。今后研究小RNA对IL-27的调控作用，还需要进行更多的探索。