佐剂或递送载体与鱼类疫苗的免疫途径综述*

张娜，吴允昆

（福建师范大学，福建 福州 350117）

2014 年，水产养殖在为人类提供食物方面的贡献首次超过了野生鱼类[1]。由于营养市场对鱼类食品的需求量增加，养鱼业的重要性日益提高且正经历着产业繁荣。但是，大多数食用鱼类通常在拥挤的环境中生长，因而很容易受到细菌、病毒的感染，这容易造成养殖业巨大的经济损失。因此，鱼类疾病防治被越来越多的人关注。

传统上，抗生素已被广泛应用于预防和治疗水产疾病，然而，滥用抗生素成为了突出问题。抗生素对疾病的治疗一方面会产生抗性菌株，另一方面也引起了人们对环境污染和消费者安全的关注，即消费者越来越关注鱼肉中的药物残留问题。因此，人们开始重视更具有安全性的鱼类疫苗的运用。

鱼类虽然是低级脊椎动物，但它具有较为完善的免疫系统[2]。早在20世纪30年代就有报道称鱼类具有免疫应答反应，因此，疫苗被认为是最理想的预防鱼类疾病的生物制剂[3]。1942年，Duff首次报道了杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)灭活疫苗不仅能有效保护鱼体，还能刺激机体产生相应抗体[4]。

目前，用于鱼类抗传染性病原体的疫苗可大致分为传统疫苗和现代疫苗。前者包括灭活疫苗和减毒疫苗，后者包括重组技术疫苗、合成肽疫苗以及DNA疫苗[5,6]。传统疫苗通常比现代疫苗更有效，传统疫苗的保护作用是由脂多糖、脂蛋白、复杂多糖以及蛋白质组成的多种抗原组合介导的[7-9]。保护作用引发了对佐剂的思考，疫苗可以通过添加佐剂来增强免疫效果，以多种天然或合成生物材料为代表的现代化疫苗递送系统以及佐剂正在得到越来越多的研究，例如，壳聚糖、海藻酸盐、脂质体、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)和碳纳米管等。硬骨鱼的皮肤和肠道与其黏膜免疫力直接相关，并在免疫防御中起着非常重要的作用[10]，佐剂和递送系统的添加使得疫苗能够更充分地接触鱼的黏膜组织。

鱼疫苗主要通过3种途径施用，即注射、浸泡、口服。本文综述和讨论了疫苗的3种免疫途径各自存在的问题，以及疫苗如何对佐剂或载体合理选择，为高效施用疫苗提供了参考思路。

1 佐剂和递送载体

疫苗是一种安全高效的预防疾病的生物制品。但有时疫苗效果不如预期，佐剂是一种能改善疫苗的适应性和保护性反应的物质，其本身不具有抗原性质。佐剂促进免疫应答的早期发作，调节适应性和非特异性免疫，并改善黏膜表面对抗原的吸收，以诱导延长免疫力，因此需要使用佐剂来优化这些疫苗的效果。佐剂包括油包水型乳剂、细胞微生物组分和植物提取物[11,12]等。研究证明，佐剂与疫苗结合确实能产生高效疫苗[13]，而且佐剂已经在鱼疫苗中使用了很长时间。例如，Montanide IMS 1312 VG油佐剂与病毒性出血性败血病(VHS)病毒混合的浸泡疫苗在橄榄比目鱼(Paralichthys olivaceus)中具有很高的保护作用[14]。Boesenbergia pandurata提取物和细菌灭活疫苗以1∶1的比例均匀混合，混合疫苗增强了罗非鱼的免疫系统对疾病的抵抗能力[15]。

纳米技术的递送载体已在疫苗开发中广泛应用。Vinay等[16]发现纳米疫苗的新制剂能有效地和选择性地将抗原递送至合适的位点，为抗原提供稳定性并可以充当载体。Tafalla等[17]发现递送载体能够改善抗原通过鳃组织，皮肤和肠道的吸附，并促进了它们在淋巴组织中的保留和缓释。例如，单壁碳纳米管就是优良的纳米级载体，因为碳纳米管具有突破皮肤屏障的能力，可以高效地将疫苗运输到鱼体内，并在鱼体中将疫苗释放引起免疫反应[18]。纳米颗粒载体具有佐剂效果的解释是，1至100 nm的纳米颗粒可以传递到淋巴结，它们可以很容易地被树突状细胞内在化并在疫苗接种部位保留很长的时间[19]。纳米颗粒极小的尺寸和大的比表面积使它们易于通过大多数生物膜而不会引起变形，有助于疫苗有效吸收[20]。因此，纳米级递送载体在鱼类疫苗中的应用越来越受到重视，不同的免疫途径与合适的纳米颗粒组合能有效地提高疫苗的免疫效果。

2 免疫途径

2.1 注射疫苗

注射疫苗是一种迄今为止对抗疾病十分有效的接种方法，因为注射免疫可以准确控制抗原的用量而对机体产生较高的免疫保护，并具有持久的免疫作用。几乎任何种类的疫苗都可以通过注射途径引起机体的免疫应答并对机体产生保护作用。链球菌病鱼灭活疫苗是经肠胃外注射给药，在受到病原体攻击时对鱼体产生保护作用[21]。连续体外传代的减毒菌株通过注射免疫，疫苗显示出显著改善的稳定性和免疫原性，能对罗非鱼产生一定的保护作用[22]。甚至亚单位疫苗、DNA疫苗等都可以通过注射直接免疫鱼体。

在注射疫苗中添加佐剂能增强免疫效果，但是早期的佐剂会产生副作用对鱼体造成伤害，新型佐剂则更安全、更高效。最近，Bwalya等[23]制备了含油佐剂的灭活自身疫苗，注射免疫后安全有效地保护罗非鱼免受加维氏乳杆菌感染，而且没有明显的副作用。现在，越来越多以纳米级颗粒为主的递送系统应用到疫苗中，它们为注射疫苗开拓了更广阔的前景。通过腹膜内注射由病毒的强毒重配株的外壳蛋白制成重组蛋白纳米颗粒VNNV-CNP，结果显示鱼的头肾中CD4和IgM上调，表明适应性全身反应被激活并在幼鱼体内产生了特异性抗体应答[24]。病毒样纳米颗粒能自组装成与天然病毒颗粒相同的完整三级结构，Wi等[25]发现病毒样颗粒疫苗(VLP)经腹膜内注射施用引起鱼高效的免疫应答，为鱼类提供了针对神经坏死病毒攻击的全面保护：100%的免疫鱼得以幸存，而接种磷酸盐缓冲盐水的对照组鱼只有37%的存活率。

然而，人工给大量的鱼注射疫苗是费力、高成本的劳动，还会造成鱼的应激反应，幼鱼也因体型太小而无法通过注射接种疫苗。研究人员想到利用机械注射能降低注射免疫的难度，仪器自动注射相对于人工注射效率高，鱼体的应激反应更小，更有利于鱼体的健康[26]。但是，仪器设备成本高，对鱼的体型也有要求，较难推广使用，因此国内至今没有普及商业化的鱼类疫苗自动注射设备。

2.2 浸泡疫苗

浸泡免疫也是一种有效的疫苗接种方法。将鱼浸入含有疫苗的水中时，环境中悬浮的抗原可能会被皮肤和鳃等吸收。皮肤和鳃上皮中的功能细胞将被激活，例如抗原呈递细胞（巨噬细胞），吸收抗原并将其运输到专门的组织中，在该组织中形成全身性免疫应答，并保护鱼类免受病原体侵害。浸泡疫苗的优势是可以对养殖的鱼进行大面积的接种，但通过鳃和皮肤吸收抗原的效率有限，因此该方法的效力低下。为了提高浸泡免疫效果，有时候采用高渗透浸泡、超声波浸泡等方法。通过牛血清白蛋白(BSA)对金鱼的保护效果研究发现，高渗透浸泡仅需简单浸泡方法抗原使用量的20%，而超声波浸泡刺激皮肤传导抗原的效果比高渗透浸泡更优，产生的抗体水平更高[27]。浸泡免疫不仅可以诱导机体产生黏膜免疫反应，还能产生系统免疫反应[28]。例如通过浸泡免疫，鱼中相应的免疫因子表达均升高，被塔氏爱德华氏菌的强毒株感染后，浸泡免疫含有PLGA的疫苗组中观察到了最高的相对存活率64.7%[29]。

浸泡免疫的时长对其免疫效果有较大影响。Moore等[30]的实验结果表明，将鱼在 BSA-PLGA微球中浸泡24 h后发现，低浓度长时间浸泡有助于提高免疫效果。将开发的纳米材料作为疫苗载体，疫苗能在缩短疫苗免疫时间并提高抗原含量的同时，产生很好的免疫效果。例如，由单壁碳纳米管作为载体，编码传染性脾肾坏死病毒的主要衣壳蛋白(MCP)基因制成亚单位疫苗(SWCNTs MCP)，功能化的单壁碳纳米管作为疫苗载体可以提高鱼中疫苗的含量，浸泡免疫鱼30 min后发现，可以在鱼中诱导强烈的针对染性脾肾坏死病毒的免疫保护反应[31]。水链球菌疫苗是用带正电的壳聚糖包被带负电的灭活细菌悬液来制备的黏膜粘附疫苗，还是一种分散在液体纳米颗粒微乳液中的高浓度抗原的疫苗，这提高了疫苗的免疫原性和功效。用疫苗对罗非鱼苗进行了30 min浸泡免疫，第2周检测到保护性抗体，且罗非鱼对病原体至少有3个月的抵抗力，攻毒后得出同等水平的未接种疫苗组和裸露疫苗组的存活率分别为10%和13%，疫苗组的存活率则为83%[32]。

出于养殖鱼类生存环境的考虑，浸泡法对于大规模免疫很方便。但皮肤屏障和细胞膜选择通透性，包括蛋白质和质粒在内的大多数生物大分子不容易进入鱼体，这也是浸泡接种疫苗应用的障碍。现代技术下的疫苗通过在制备过程中修饰合适的材料，已经在很大程度上解决了屏障问题并且保护了抗原。例如，碳纳米管可以穿透皮肤屏障，通过受体介导的内吞作用进入细胞。 Zhao等[33]使用单壁碳纳米管作为载体的DNA疫苗免疫鱼，疫苗组存活率高达82.4%，裸DNA疫苗组存活率仅为54.2%，表明功能化的单壁碳纳米管是一种有前途的浸入式DNA疫苗载体。

2.3 口服疫苗

口服疫苗已成为鱼类疫苗接种的理想方法。口服免疫是将抗原和饲料混合，通过投料或者口饲管插管，将疫苗通过主动摄食的方式引入鱼体。口服疫苗在给药途径上具有很大优势，可以避免鱼的应激反应、省时省力，而且能通过黏膜接触引起免疫反应，从而产生更好的免疫效果。但是，在口服疫苗的使用中，由于小肠中存在许多蛋白酶和其他酶，因此在细胞摄取抗原之前，剧烈的消化或失活常常阻碍了抗原的成功递送。

为了防止胃肠道等的恶劣条件并控制大肠中蛋白质的运输，我们课题组[34]设计了一种智能的PMMMA-PLGA二元壳。用PTRBL/Trx-SIP口服免疫后，在实验罗非鱼的抗血清中产生了高水平的特异性抗体IgM，并对鱼体产生100%的保护作用。PMMMA-PLGA/Trx-SIP口服疫苗可将抗原靶向罗非鱼的大肠，将抗原(FITC标记的Trx-SIP)递送至脾脏和肾脏，PMMMA纳米壳具有pH调节的羧基响应性溶胀和相变，可以保护PLGA纳米颗粒免受胃和小肠消化的影响，从而绕过小肠中纳米颗粒对细胞的选择性吸收，然后释放PLGA/抗原纳米颗粒供在大肠中细胞摄取。这项关于PMMMA-PLGA PTRBL载体的研究证明，新型材料的开发使得口服疫苗具有更高实用性。

此外，还可利用基因敲除技术改造抗原，使鱼用口服疫苗更安全。早期制备的口服减毒疫苗由于稳定性差，免疫反应较弱，免疫保护持续时间短，或生长速率低，限制应用[35]。Li等[36]发现罗非鱼无乳链球菌减毒菌株YM001中D2片段的缺失是罗非鱼链球菌失去毒性的主要原因，因此研究构建了亲本强毒株HN016中D2片段缺失的Δ2突变体，并对其安全性、稳定性、免疫原性以及致病机理进行了评价。结果表明，Δ2突变体对罗非鱼没有致病性，并且在传代50代后未观察到强毒回复株，与YM001相比，Δ2突变体是无乳链球菌的一种有希望的、更好的减毒口服疫苗菌株。

现阶段我们不仅要优化抗原，还需要把口服疫苗研究的重心放在现代技术上，制备、开发和应用更适合的疫苗递送系统，以此得到高效的口服疫苗。递送系统可以在结构上模拟抗原，引起机体免疫反应。Bacterial Ghost是非常有价值的无生命载体，BG是无生命的革兰氏阴性细菌细胞膜，BG的生产过程不会使细菌的包膜或表面蛋白变性，也不会保留病原体相关的分子模式(PAMP)[37]。它们可以在一个或多个细胞位置携带外来抗原、核酸和药物。它们易于生产以及无需冷藏即可进行存储和加工及其出色的安全性(即使以高剂量给药)，并且具有天然佐剂特性，还可利用BG及其同伴的相同表面受体来靶向特定的细胞和组织。因此，这是一种在水产养殖实践中开发更有效口服给药疫苗的出色技术[38]。同样，病毒样颗粒在表达系统中能自组装成病毒固有结构，能被抗原呈递细胞识别。口服管饲法肠胃外施用的病毒样颗粒疫苗引起高效的免疫反应，口服疫苗给予全身激发抗体，并赋予抵抗病毒攻击的保护性免疫力，经攻毒后57%的鱼得以幸存[25]。

3 最适的免疫途径

接种疫苗是预防水产养殖传染病最有效的方法。而免疫途径影响疫苗的效果，Li等[39]得出减毒活疫苗以口服、浸泡和注射的方式对尼罗罗非鱼的相对保护率分别达到71.81%、67.22%和96.88%。Chien等[40]人在石斑鱼中尝试口服、浸泡、注射免疫3种不同的途径，并经过攻毒后，鱼的存活率为口服52.3%、浸泡81.9%、注射61.4%。可见，每种疫苗都有最高效的免疫途径。添加佐剂也能影响免疫途径的免疫效果，Hardi等[15]在疫苗中添加植物提取物为佐剂，浸泡法比口服法更好地提高了疫苗的效力。浸泡疫苗的存活率为83%～100%，口服为83%～87%。重组蛋白纳米颗粒的递送系统通过2种途径免疫鱼，在注射组中发生了实质性的特异性抗体扩增，注射鱼的头肾脏中CD4和IgM上调，表明适应性全身反应被激活，在口服组中肠道处表现出黏膜反应[24]。

还有研究发现，结合使用不同免疫途径，同样能提高鱼的存活率。Kole等[41]人对橄榄比目鱼使用了2种接种方案，首先通过浸泡对所有鱼进行免疫，2周后用同样剂量疫苗，一半的鱼通过浸泡免疫，另一半通过口服免疫(掺入鱼饲料中）。病原体攻击后在浸泡/口服组中相对存活率73.3%，浸泡/浸泡组相对存活率为60%，而在另一项口服/口服组的试验研究中，仅获得了23.3%的相对存活率。因此，可以推断出所采用的免疫策略有效地保护了灭活的病毒抗原。这表明可以尝试不同的免疫途径和组合以优化响应，为免疫途径开拓了新思路。

4 展望

注射免疫具有剂量准确、产生免疫应答能力强、持续时间长的优点，多项实验表明佐剂能提高和延长注射免疫应答，免疫次数少就能引起机体的免疫应答。但是同时，注射免疫的缺点显而易见。注射不仅耗时耗力，而且对于体型较小或者在幼年时期就容易感染疾病的鱼体而言，注射免疫不是最佳的接种途径。注射也会损伤鱼体，还伴随着鱼类会产生应激反应。随着能够穿透皮肤屏障的纳米材料的应用，浸泡免疫相对注射免疫具有更加广阔的前景。口服疫苗将是近年来的研究重点，这是一种颇具优势的免疫方式。

尽管由现代分子生物学发现的新抗原和疫苗呈指数增长，但安全有效的佐剂和递送载体的匮乏是其应用的限制因素之一。大量的研究表明大部分纳米颗粒的载体具有佐剂效果，可以不费力地递送抗原、保护抗原免于变性降解，许多研究也证明了合适的佐剂和递送系统能更有效地提高疫苗的作用。而利用不同的佐剂制备疫苗，确实能产生不同水平的免疫应答[42]。通过运用更合适的佐剂和递送载体，疫苗效果能达到鱼类疫苗商业化。相信在今后，更便利、低成本、高效应的疫苗将会通过更合适的接种途径在经济鱼类中得到广泛的应用。