胰腺癌缺氧微环境的生物学作用

张 雨， 江建新

武汉大学人民医院 肝胆外科， 武汉 430060

胰腺癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一，号称“癌中之王”，因早期诊断困难、手术切除率低以及放化疗不敏感，预后极差，5年生存率仅为9%。据最新数据[1]，预估2019年美国胰腺癌男性与女性发病分别为29 940例和26 830例，发病率分别居肿瘤排行榜的第10位和第9位，而预计胰腺癌的死亡率居第4位。目前，中国胰腺癌总发病率和死亡率在所有恶性肿瘤中分别居第10位和第6位[2]。尽管近几年胰腺癌的治疗手段有所提高，但仍无里程碑性突破，其主要原因在于胰腺癌的发病机制尚未完全清楚。

1889年，Pagets[3]首次提出“种子与土壤”假说，认为肿瘤生长需要合适的环境，随后肿瘤微环境的概念逐渐确立。肿瘤微环境是由肿瘤细胞、炎性细胞、内皮细胞、源于髓系的造血细胞、成纤维细胞、细胞外基质及各种生物活性分泌产物共同组成的内环境，参与肿瘤的发生、发展及转移[4]。1955年以后，缺氧被认为是肿瘤微环境的特性之一。缺氧条件下，缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)会高表达，调节相关靶基因及各种细胞信号通路以耐受缺氧。癌细胞发生一系列代谢、生物学特性改变，包括糖脂代谢异常、异常血管新生、上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)等，促进癌细胞不断增殖，侵袭力加强，使其易于远处转移[5-6]。另外，缺氧使肿瘤相关巨噬细胞及嗜中性粒细胞向促瘤表型转化，同时T淋巴细胞、自然杀伤细胞杀伤作用被抑制，有利于肿瘤的免疫逃避[7]。已有报道[8]，缺氧微环境还与放化疗等治疗抗性相关。在胰腺癌中，其微环境的显著特性为极度缺氧，另一特性在于基质细胞分泌大量致密结缔组织，这一过程由胰腺星形细胞(pancreatic stellate cell，PSC)介导[4,9]。缺氧的主要原因在于血管生成不足或形成异常渗漏血管导致低血流灌注；其次，胰腺癌不仅分泌促血管因子，也分泌内皮素等抗血管因子，且致密的基质压迫血管导致缺氧进一步加剧[9]。总体而言，缺氧微环境在促进胰腺癌代谢重建、免疫逃避、增殖和转移、耐药等方面至关重要，多种生物学因子共同参与此过程，如血管内皮生长因子(vascular endorhelial growth factor，VEGF)、TGFβ、IL-10、趋化因子，而转录因子HIF作为核心调控因子，介导多种生物学作用发生。

HIF是一种异二聚体转录因子，存在3种功能形式(HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α)。常氧条件下，HIF-1α在脯氨酸羟化酶作用下羟化脯氨酸残基，经希佩尔-林道蛋白介导的泛素-蛋白酶体途径降解。缺氧时α亚基的降解活动显著减弱，进入胞核与HIF-1β 结合形成具有活性的转录复合物，并与靶基因上游缺氧反应元件结合，参与缺氧引起的多种系统性反应[9-11]。HIF-1α已被证实在胰腺癌中过表达，其介导的生物学作用包括上调VEGF促进新生血管形成，上调基质金属蛋白酶(MMP)和诱导EMT促进癌细胞侵袭和转移，并通过改变巨噬细胞极化方向帮助肿瘤免疫逃避，还可上调糖酵解基因改变代谢途径并与化疗耐药相关[7,9-11]。HIF-2α具有与HIF-1α相似的结构域，其作用相似但机制不同，甚至在特定的情况下二者的功能截然相反[10]。Wang等[12]通过检测HIF-1α和HIF-2α mRNA及蛋白质水平，发现高表达的HIF-2α可能与胰腺癌的良好预后相关。关于HIF-3α，以往认为其抑制HIF-1α和HIF-2α的功能，而近年来提出HIF-3α可能作为HIF-1α的靶基因在缺氧时起作用并促进胰腺癌转移[13]。

1 缺氧微环境对胰腺癌的作用及机制

1.1 缺氧参与胰腺癌代谢重建

缺氧时，细胞中葡萄糖正常代谢途径氧化磷酸化受阻，线粒体内膜电子呼吸链传递异常，导致ATP生成减少及活性氧(ROS)增多。ROS进一步导致线粒体损伤，并依赖溶酶体途径诱导自噬[14]。为适应缺氧环境，满足癌细胞生长发育的能量需求，细胞的代谢过程会重新建立，主要通过HIF-1激活，关闭氧化磷酸化促进糖酵解，并调节谷氨酰胺代谢及推动三羧酸循环向脂肪酸合成代谢转变[15-17]。缺氧可上调脂肪酸合酶基因的表达，也通过HIF-1诱导VEGF激活多种信号通路，如RAS/RAF/ERK和PI3K/Akt通路，进一步促进脂质合成[15-16]。在胰腺癌的代谢重建中，异常糖代谢途径和改变来源的乙酰辅酶A(acetyl coenzyme A，乙酰CoA)的脂质合成途径至关重要。

1.1.1 有氧糖酵解 正常细胞有氧时通过氧化磷酸化供能，缺氧时进行糖酵解，但在肿瘤细胞中，即使是在有氧条件下糖酵解途径也异常增强，该过程为有氧糖酵解，又名“Warburg效应”。缺氧时，HIF-1α活化，靶向上调糖酵解及葡萄糖转运载体基因，加强葡萄糖摄取，导致丙酮酸无法氧化脱羧而生成乳酸，从而迅速产生大量ATP，比正常氧化磷酸化快100倍，并参与核酸、脂肪等大分子合成以满足癌细胞快速增殖需要。同时，有氧糖酵解使线粒体内ROS、CO2、ATP及柠檬酸盐产生减少，有利于基因稳定，降低ATP和柠檬酸盐对糖酵解关键酶磷酸果糖激酶1(phosphofructokinase 1，PFK1)的抑制作用，CO2生成减少亦有利于维持胞内碱性环境，提高PFK1活性，并抑制氧化磷酸化[15,17]。

1.1.2 谷氨酰胺代谢途径 谷氨酰胺再摄取增强是肝癌、肺腺癌等的一个显著特征，胰腺癌中谷氨酰胺代谢紊乱是肿瘤发生所必需，其在三羧酸循环中间产物的再生、脂质合成以及还原型辅酶Ⅱ(NADPH)产生中尤为重要。谷氨酰胺进入线粒体，在谷氨酰胺酶的作用下分解为氨和谷氨酸，后者进入两条代谢通路。(1)非经典谷氨酰胺代谢途径：谷氨酸经谷草转氨酶1生成天冬氨酸，天冬氨酸出线粒体后，在致癌基因KRAS介导的天冬氨酸转氨酶/谷草转氨酶1作用下生成草酰乙酸，草酰乙酸经苹果酸脱氢酶1变为苹果酸，苹果酸再经苹果酸酶1脱氢生成丙酮酸，同时生成NADPH还原当量，参与氧化还原反应，减少ROS生成，促进癌细胞生长。(2)经典谷氨酰胺代谢途径：谷氨酸经谷氨酸脱氢酶1生成α-酮戊二酸，可直接参与三羧酸循环并在胞浆内通过mTOR信号抑制自噬过程。研究[15]发现，与其他肿瘤依赖谷氨酰胺摄取增强生存力不同，胰腺癌中，谷氨酰胺再摄取最终会抑制癌细胞生存。探讨其原因，在肿瘤代谢中，自噬具有双重调控作用，一方面激活自噬性死亡途径杀灭瘤细胞；另一方面，癌细胞可通过自噬获取能量逃避凋亡。在胰腺癌的缺氧微环境下，发现其自噬水平升高，可能的原因是部分肿瘤细胞通过自噬作用代谢自身相关物质为周围的肿瘤细胞提供营养。另有研究[18]发现，自噬可能与ROS减少和维持基因稳定相关。

1.1.3 改变来源的乙酰CoA的脂质合成途径 脂肪酸合成对于癌细胞的生长必不可少，参与细胞分裂等重要过程。乙酰CoA是合成脂肪酸的主要原料，正常情况下主要通过丙酮酸在线粒体氧化脱羧生成，而胰腺癌细胞由于缺氧阻断了葡萄糖的有氧氧化，为适应生存，乙酰CoA来源通过其他途径替代。(1)非经典谷氨酰胺代谢途径中，谷氨酸经谷氨酸脱氢酶1生成α-酮戊二酸，经异柠檬酸脱氢酶1生成异柠檬酸，后者在胞浆中生成柠檬酸。(2)原癌基因c-Myc介导的谷氨酰胺代谢经三羧酸循环直接生成柠檬酸，柠檬酸在胞浆经ATP柠檬酸裂解酶进一步裂解生成乙酰CoA。(3)胞浆中，乙醛经乙醛脱氢酶变为乙酸，在酰基辅酶A合成酶短链家族成员2作用下生成乙酰CoA。最后共同通路为乙酰CoA合成脂肪酸[16]。

1.2 缺氧与胰腺癌细胞免疫逃避 间质细胞是胰腺癌微环境的重要组成成分，包括PSC、调节性T淋巴细胞(Treg)、髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cell，MDSC)以及肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage，TAM)。免疫抑制是肿瘤微环境特性之一，其机制复杂多变并与缺氧密切相关[6]。缺氧时，上调的HIF-1α激活PSC变为肌成纤维细胞样表型，活化的PSC可以增加Ⅰ型胶原密度并干扰趋化因子受体引导T淋巴细胞归巢[19]，还可分泌TGFβ、IL-6、galectin-1等多种因子，其中CXC趋化因子配体(CXC chemokine ligand，CXCL)12表达能阻止CD8+T淋巴细胞迁移至肿瘤基质，而galectin-1可促进T淋巴细胞凋亡和Th2细胞因子分泌实现免疫抑制[6]。

PSC还通过IP-10/CXCL10途径招募Treg帮助癌细胞免疫抑制。Treg是一种抑制性T淋巴细胞，可分泌免疫抑制因子IL-10、TGFβ抑制效应性T淋巴细胞或分泌galectin-1促进T淋巴细胞凋亡，并且通过高表达细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4使树突状细胞和效应性T淋巴细胞上调吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)，而IDO及其代谢产物犬尿氨酸与免疫抑制相关。PSC亦通过IL-6/STAT3信号促进MDSC形成，后者可由IL-10、TGFβ诱导释放ROS，激活caspase级联反应并引起T淋巴细胞凋亡。同时，MDSC可以通过改变抗原来诱导CD8+T淋巴细胞免疫耐受，并通过精氨酸酶1和诱生型一氧化氮合酶消耗L-精氨酸使T淋巴细胞无法增殖；STAT3磷酸化后还可上调表面的程序性死亡配体-1抑制T淋巴细胞激活[6]。

缺氧时，HIF-2α及IL-4、IL-10、IL-13和巨噬细胞集落刺激因子等，可促进巨噬细胞向免疫抑制表型M2型分化，促进胰腺癌增殖[5,16]。微环境还可分泌VEGF、IL-10、IL-6和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子等防止树突状细胞成熟，未成熟树突状细胞可以减少共刺激分子CD40和CD80的表达来防止T淋巴细胞激活，同时产生趋化因子22招募Treg促进肿瘤存活，但缺氧对于树突状细胞的作用仍有争议[19-20]。

1.3 缺氧与胰腺癌的增殖和凋亡 缺氧条件下，HIF-1α可以加强糖酵解等能量物质转换，上调红细胞生成素及VEGF，这些变化均推动了肿瘤的恶性增殖。不受调控的生长是恶性肿瘤的特性之一，许多研究表明缺氧在其中起着不可替代的作用。Jein等[21]发现，缺氧通过HIF-1α与近端缺氧元件B7-H4启动子结合，诱导胞浆中B7-H4高表达，后者可影响细胞周期进展，增加S期细胞群促进增殖，而沉默B7-H4后，细胞凋亡数增加且增殖活性下降。另外，Barbu等[22]研究表明，在胰腺内分泌瘤的转基因小鼠中，由缺氧介导的脯氨酸表达增加，可推动细胞周期进展和细胞生长并推测其依赖于激活ERK通路。

Bcl-2相互作用蛋白3(Bcl-2 interacting protein 3，BNIP3)是缺氧诱导细胞凋亡的关键信号，可抑制细胞增殖。Li等[23]报道，BNIP3因为启动子甲基化不能与HIF-1α结合，在胰腺癌中表达沉默，与正常表达BNIP3细胞相比，其促凋亡蛋白Bax表达和细胞凋亡数减少，抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加，提示BNIP3是细胞抗凋亡及耐药靶点之一。Harashima等[24]发现，在沉默HIF-2α的胰腺癌细胞系中，检测到TNF相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)的敏感性增高，生存素(survivin)表达减少；而在高表达HIF-2α细胞中发现凋亡相关分子减少，survivin高表达。该研究还检测到HIF缺氧应答元件中存在与survivin启动子一致的序列，暗示了HIF-2α可以上调survivin表达，降低TRAIL敏感性，促进凋亡抵抗过程。以胶质瘤、肝癌和肺癌患者为研究对象[25]，结果发现缺氧可以激活SOX-2、CT-4、KLF-4、Nanog和Lin-28A等转录因子，这些基因在控制细胞去分化及形态重塑中起着重要作用，并增加干细胞标志物的表达，诱导肿瘤球的形成及不对称的细胞分裂，使细胞周期停滞在G0/G1期，这些都是肿瘤干细胞的特性。已经证实，在胰腺癌中也存在SOX-2推动去分化过程，因此推测缺氧可能通过去分化诱导肿瘤干细胞形态形成，增加恶性程度。

1.4 缺氧与胰腺癌侵袭和转移 作为乏氧性实体瘤，胰腺癌通过各种途径促进血管和淋巴管生成以满足营养需求，这也有利于癌细胞的进一步扩散转移。郑刚等[26]研究发现胰腺癌中HIF-1α mRNA表达上调，且与VEGF mRNA表达呈正相关，说明HIF-1α可通过上调VEGF 表达促进血管生成。缺氧时，基质细胞会分泌大量促血管生成因子，其中VEGF至关重要，并由STAT3信号、黏蛋白1、核因子-κB(NF-κB)、TAM等调节。此外，M2型巨噬细胞和CD10+PSC还可促进淋巴管再生并驱动淋巴结转移，且VEGF-C/D可能也与之相关[6]。Yang等[27]发现，HIF-2α高表达可以通过调节Twist1与血管内皮钙黏蛋白的结合致胰腺癌血管拟态形成。血管生成拟态是一种独立于内皮细胞血管生成的血液供应方式，与胰腺癌转移密切相关。

许多报道中，EMT在胰腺癌侵袭转移中发挥着独特作用[6,9-10]。王时光等[28]通过检测HIF-1α、转录因子Snail、N-钙黏附素、E-钙黏附素的表达，证实了在缺氧时HIF-1α介导EMT 促进胰腺癌细胞侵袭迁移。吴飏等[29]也发现缺氧微环境中PSC可通过CCL7/CCR5轴诱导EMT促进胰腺癌侵袭。EMT可使细胞黏附能力及极性丢失，突破基底膜入侵局部静脉，抑制细胞凋亡并赋予其干细胞特性增加侵袭力[6,9-10]。除HIF-1α作用外，Zhang等[30]研究了HIF-2α和β-连环素(β-catenin)在胰腺癌中的相互作用，发现HIF-2α可上调β-catenin活性进而调节EMT过程，并促进癌细胞增殖、转移。

Zhou等[13]研究证明，缺氧时HIF-3α表达上调，增加磷酸化肌球蛋白轻链2水平，暗示RhoC-ROCK1通路激活，并减少了胰腺癌患者生存时间，促进转移。RhoC属于小分子G蛋白超家族中的Rho亚家族，与细胞骨架运动调控、细胞形态建成相关，且涉及细胞黏附、细胞基质相互作用。因此，HIF-3α表达上调可以促进胰腺癌局部浸润和远处转移。HIF-1α还通过MMP，如MMP-2和MMP-9表达增加，降解细胞外基质促进癌细胞转移[6,11]。PSC在促进肿瘤转移和侵袭中发挥了重要作用，PSC可以通过Galectin-1分子激活NF-κB途径来分泌基质细胞衍生因子-1促进转移，也分泌肝细胞生长因子(HGF)与癌细胞表面c-Met结合通过HGF/c-Met/survivin信号发生转移[6]。此外，肿瘤免疫逃避也参与了其侵袭和转移。

1.5 缺氧与胰腺癌治疗耐药相关性 胰腺癌缺氧微环境激活PSC，促纤维化及致密结缔组织形成并与缺氧形成恶性循环。致密结缔组织导致的血管塌陷以及肿瘤中心的低血流灌注，共同阻止了药物渗透，是导致胰腺癌耐药的机制之一[31]。Grasso等[32]讨论了胰腺癌异常糖代谢与耐药相关性，认为可能与某些糖代谢调节酶相关，如己糖激酶(HK)、果糖-二磷酸醛缩酶(FBA)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)在缺氧时过表达。HK2可以直接插入线粒体外膜对抗凋亡，由PI3K/Akt/mTOR通路启动，从而促进耐药。FBA通过抑制caspase3的活性延缓凋亡，而GAPDH可以通过促进糖酵解、自噬，阻止caspase非依赖性死亡途径，上述改变均提高了耐药性。此外，代谢产物乳酸的积累，通过NDRG3蛋白与C-Raf结合开启生存信号，同时促进药物治疗抵抗。

胰腺癌EMT也被证实与治疗耐药密切相关，多项研究提示EMT细胞对胰腺癌治疗药物包括表皮生长因子受体抑制剂、吉西他滨、VEGF抑制剂有抗性，如表达EMT标记的胰腺细胞对表皮生长因子受体抑制剂的抵抗力增强，在抗吉西他滨的胰腺癌细胞中间质波形蛋白、ZEB1、Notch通路产物及其下游信号NF-κB表达均上调，推测胰腺癌可能依赖Notch信号通路诱导EMT。在某些抗VEGF的细胞中，其促炎因子水平升高，可招募CD11b+血管生成性髓样细胞诱导EMT[33]。He等[34]发现缺氧还可通过激活ERK1/2/HIF-1α调节ATP结合盒G亚家族成员2(ATP-binding cassette subfamily G member 2，ABCG2)活性，而ABCG2与多药耐药相关，作为一个可能的耐药靶点促进胰腺癌耐药。Luo等[35]研究显示，miR-301a在低氧诱导的胰腺癌吉西他滨耐药中起重要作用。TAp63为p63家族成员之一，能促进HIF-1α降解对抗耐药。缺氧时miR-301a依赖于NF-κB途径上调，可以使TAp63表达降低，促进吉西他滨耐药。

2 总结

胰腺癌发生的微环境复杂多变，缺氧作为其重要特性之一，与肿瘤的发生、发展及转移密切相关。肿瘤快速生长导致血流供应不足是缺氧发生的早期条件，而结缔组织增生及大量纤维化使缺氧进一步加剧。为适应缺氧，避免凋亡并获得持续增殖，一系列信号通路及调节因子分泌，重建癌细胞的能量代谢，促进微环境血管再生并诱导EMT过程增强侵袭力，同时调节免疫系统达到免疫抑制并对抗凋亡途径。总之，胰腺癌缺氧微环境与患者的不良预后、早期转移、治疗效果不佳有关，根据其生物学作用，一系列新的治疗策略如抗VEGF、免疫靶向治疗成为当下研究热点。因此，进一步探究缺氧微环境在胰腺癌中的具体作用以及分子机制，对提高胰腺癌疗效至关重要。