产KPC-2 型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌耐药致泌尿系感染机制分析

刘拥荣，余亚敏，李丽君，卢胜男，罗文婷，贺立飞

（1.宁乡市人民医院检验科，宁乡 410600；2.宁乡市人民医院内科，宁乡 410600）

泌尿系感染（Urinary tract infection，UTI）是临床常见的感染性疾病［1］，是由于病原菌侵入尿路上皮导致的炎症反应，患者会因此出现膀胱刺激征及发热等的临床症状。UTI 的病原菌通常为肠道正常菌群的移行异位引起的感染，故多为肠杆菌科细菌，常见的病原菌是大肠埃希菌（Escherichia coli，EC）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）等细菌［2］。临床根据尿培养和药敏试验结果选择敏感抗菌药物进行治疗，而近年国内大量抗菌药物的应用也使得泌尿系感染病原体的分布发生改变，导致产超广谱B-内酰胺酶（ESBLs）大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的菌株不断增加［2-3］。

碳青霉烯类药物是临床做为治疗ESBLs 引起的严重感染的抗菌药物，对β-内酰胺酶有较强的稳定性，但国内外对碳青霉烯类药物的大量不合理使用导致其耐药菌的出现逐渐频繁，以肺炎克雷伯菌尤为突出，对碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌（CRKP）的检出率逐年升高［4-5］。产KPC 型碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药最常见机制，在KP 以KPC-2 及KPC-3 较为常见，其中又以KPC-2 基因型最容易引起院内感染的暴发流行［6］。

本研究对2018 年4 月～2019 年4 月宁乡市人民医院CRKP 致泌尿系感染的病例进行收集，对产KPC-2型碳青霉烯酶的菌株进行分离菌株编号，利用聚合酶链反应（PCR）对其进行荚膜血清型基因及毒力基因的检测，采用体外验证的方式确定菌株在小鼠体内的高毒力性，为对于CRKP 的治疗提供研究依据。

1 资料与方法

1.1 材料全自动细菌鉴定仪VITEK 2 Compact（法国生物梅里埃公司）；PCR 扩增仪（ABI Applied 公司）；引物合成公司为上海生工。BALB/C 雌性小鼠共36 只，购自华北理工大学动物实验中心，6～8 周龄，体重18～25g，随机分为三组：NC：未检出毒力基因的产KPC-2 酶肺炎克雷伯菌感染的小鼠；K1：荚膜血清型为K1 的产KPC-2 酶肺炎克雷伯菌感染的小鼠；K2：荚膜血清型为K2 的产KPC-2 酶肺炎克雷伯菌感染的小鼠。

1.2 病例收集及菌株分离2018 年4 月～2019 年4 月宁乡市人民医院住院患者中CRKP 致泌尿系感染的病例。由尿液中分离CRKP。CRKP 组入选条件为对碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌，标本编号CRKP1-CRKP12。

1.3 PCR 检测产KPC-2 酶肺炎克雷伯菌的荚膜血清型及毒力基因模板制备采用煮沸法，-20 ℃ 保存待用。PCR 分别扩增12 株肺炎克雷伯。

菌的6 种高毒力荚膜血清型基因（K1、K2、K16、K20、K54、K57）及5 种常见毒力基因［magA（K1）、rmpA、mrkD、wabG、allS］，PCR 引物、体系和扩增条件参照相关研究［7-8］。

1.4 产KPC-2 酶肺炎克雷伯菌在体毒力验证将对数生长期的肺炎克雷伯菌（NC：未检出毒力基因的产KPC-2 酶肺炎克雷伯菌；K1：荚膜血清型为K1 的产KPC-2 酶肺炎克雷伯菌；K2：荚膜血清型为K2 的产KPC-2 酶肺炎克雷伯菌）分别用生理盐水配制成0.5 麦氏单位（108 cfu/mL），再用生理盐水5 倍依次稀释至相同的感染剂量，腹腔注射感染BALB/C 雌性小鼠（12 只/组），感染后连续观察记录小鼠的死亡数。动物饲养等参照相关文献进行操作［9］。动物感染实验严格按照宁乡市人民医院伦理委员会制定的指导方针进行。

1.5 统计学分析利用GraphPad Prism 5.0 软件分析，实验结果以均值±标准误差表示，组间比较采用χ2检验，P＜0.05 为有显著性差异。

2 结果

2.1 病例信息及菌株收集情况收集2018 年4 月～2019 年4 月宁乡市人民医院CRKP 致泌尿系感染的病例35 名，年龄于46 岁～63 岁，平均年龄57 岁，男25名，女10 名，多伴有基础疾病（高血压及糖尿病），其中83.3%的患者进行过侵入性操作，以碳青霉烯类抗菌药物使用居多（19/35，54.29%），三代头孢及氨基糖苷类抗菌药物使用率较少（10/35，28.57%）。

产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌中，12 株产KPC-2酶，1 株产IMP-4 酶，2 株产NDM-1 酶，4 株产VIM-2酶。共收集12 株产KPC-2 酶的肺炎克雷伯菌。

2.2 产KPC-2 酶肺炎克雷伯菌的荚膜血清型及毒力基因检测荚膜血清型检测中，12 株产KPC-2 酶型肺炎克雷伯菌中，毒力荚膜血清型检出3 例，2 种，分别为K1 型及K2 型，其中K2 型2 例，K1 型1 例，其他荚膜血清型均未检出（表1）。

毒力基因检测中，K1 携带2 种毒力基因：rmpA、magA（K1），K2 携带3 种毒力基因：magA（K1）、rmpA、mrkD。magA（K1）及rmpA 被检出率最高，且均存在于K1 及K2 型中，其他基因均未检出（表1）。

表1 产KPC-2 酶肺炎克雷伯菌的荚膜血清型及毒力基因检测结果。

2.3 产KPC-2 酶肺炎克雷伯菌在体毒力结果据产KPC-2 酶肺炎克雷伯菌感染的小鼠死亡率结果，与未检出毒力基因的CRKP 对比，注入K1 及K2 型菌株的小鼠死亡率于第7 天死亡率更高（P＜0.01），感染了K2型菌株的小鼠于第4 天死亡率达100%，感染了K1 型菌株的小鼠于第5 天死亡率到达100%（图1）。

3 讨论

图1 产KPC-2 酶肺炎克雷伯菌感染的小鼠死亡率曲线。与NC相比，*P＜0.05，**P＜0.01。（NC：未检出毒力基因的产KPC-2 酶肺炎克雷伯菌感染的小鼠；K1：荚膜血清型为K1的产KPC-2 酶肺炎克雷伯菌感染的小鼠；K2：荚膜血清型为K2的产KPC-2 酶肺炎克雷伯菌感染的小鼠。）

近年来，由于抗菌药物的广泛滥用，引起肺炎克雷伯菌导致的泌尿系感染比例逐年升高，多种抗菌药物耐药的CRKP 检出率不断增加，给临床的感染防控及治疗增加了难度［10］。众多研究表明，碳青霉烯类抗菌药物耐药涉及多种因素，包括产生各种碳青霉烯酶、外膜蛋白的缺失、外排泵的过表达等，其中以产碳青霉烯酶为主，这些酶包括按Ambler 分类中的A、B、D 类，其中以A 类中KPC 型碳青霉烯酶为主。至今已发现的KPC酶亚型有KPC-1/2～13，以KPC-2 在临床分离菌株中最为常见，且是引起大多数暴发流行的主要类型［11］。本课题组收集了共12 例2018 年4 月～2019 年4 月宁乡市人民医院产KPC-2 型碳青霉烯酶CRKP 致泌尿系感染的病例菌株，年龄于46 岁～63 岁，多伴有基础疾病，其中83.3%的患者进行过侵入性操作，以碳青霉烯类抗菌药物使用居多，三代头孢及氨基糖苷类抗菌药物使用率较少。抗菌药物的选择及有效性对于临床治疗任务来说十分重大。为明确产KPC-2 碳青霉烯酶的CRKP 致病机制，本课题组对KPC-2 碳青霉烯酶的CRKP 致泌尿系感染的患者致病菌株进行分离收集，利用PCR 对荚膜血清型基因及常见毒力基因进行检测，将检出具有高毒力荚膜血清分型的菌株进行毒力基因的检测，明确其致毒的关键；将处于对数生长期的高毒力荚膜血清分型菌株注入小鼠腹腔，记录死亡率，验证其高毒力。

荚膜多糖是肺炎克雷伯菌的主要毒力因子。根据荚膜多糖（K 抗原）分型，可将肺炎克雷伯菌分为 82 个K 血清型，毒力较强的血清型为K1、K2、K3、K5、K20、K54 和K57 型［12］。本研究中12 株菌株检出K1 及K2型，其中K2 型居多，说明本院产KPC-2 酶肺炎克雷伯菌的荚膜血清型主要为K2 型，其次为K1 型。KABHA等认为肺部感染的肺炎克雷伯菌主要是K2 型，此类菌株缺少“甘露糖-α-2／3-甘露糖”结构，可以逃避肺表面蛋白、甘露糖受体相关的吞噬作用，更有利于其在肺部定植从而引起感染［13］。推测本院检出的产KPC-2的CRKP 致病作用与其逃避表面活性蛋白及甘露醇受体吞噬有关。5 种常见毒力基因（magA（K1）、rmpA、mrkD、wabG、allS）检测结果发现，magA（K1）及rmpA 被检出率最高，且都于K1 及K2 血清型种，K1 携带2 种毒力基因：rmpA、magA（K1），K2 携带3 种毒力基因：magA（K1）、rmpA、mrkD，其他基因均未检出。证明毒力基因的携带造成高毒力荚膜血清型菌株，也表明产KPC-2 酶肺炎克雷伯菌也或可在高毒力荚膜血清型如K1、K2 型中产生［14］。

在体毒力实验结果表明，与未检出毒力基因的CRKP 对比，注入K1 及K2 型菌株的小鼠死亡率于第7天死亡率更高，且感染了K2 型菌株的小鼠于第4 天死亡率已达100%，而感染了K1 型菌株的小鼠于第5 天死亡率到达100%，证明K2 型菌株毒力更强，造成的死亡率更高。与毒力基因的检测结果结合，提示K2 型菌株因携带更多毒力基因，导致毒力更强。

综上，本研究通过收集并分离12 株产KPC-2 碳青霉烯酶的CRKP 致泌尿系感染患者的致病菌株，通过PCR 检测其荚膜血清型及毒力基因并进行小鼠的在体毒理实验后，发现本院产KPC-2 碳青霉烯酶的CRKP可能在携带更多毒力基因从而造成更强毒力的高毒力荚膜血清型如K1、K2 型中产生。本研究对本院产KPC-2 碳青霉烯酶的CRKP 致泌尿系感染的机制进行了初步探讨，为本院CRKP 的防控提供进一步治疗的线索，为CRKP 的研究治疗提供数据依据。