响应面法优化爬山虎落叶中多糖的提取工艺

黄丽萍，高丽娟

（辽宁科技大学 化学工程学院，辽宁 鞍山 114051）

多糖（Polysaeeharides）是一种天然的高分子化合物，在生命活动的维持中有着无法替代的作用。植物活性多糖具有多种药理活性，成为天然药物研究的热点之一。

爬山虎［1］，葡萄科爬山虎属，原产美国东部［2］，在绿化中已得到广泛应用，落叶资源极其丰富。爬山虎的茎、叶、果实、种子等处均含有植物多糖。夏秋红［3］等测定爬山虎的果、茎、叶中的多糖含量分别为6.39%、21.88%、11.77%。梁晓霞［4］研究发现，通过阴离子交换和凝胶色谱法从爬山虎的茎中提取得到多糖，当多糖浓度达到一定值时，对自由基的抑制作用与丁基羟基甲苯相当，对细菌和真菌均具有抑制作用。董爱文［5］研究发现，爬山虎多糖对细菌和真菌均有一定抑制作用，而且根、茎中所含多糖比其果实中多糖的抑制作用更强。但没有文献报道爬山虎落叶中多糖的功效如何，这与落叶中成分复杂，提取纯化达到一定浓度很困难有关。

植物多糖常以水煎法、酸碱溶液浸提法、乙醇溶液浸提法，配合微波或超声辅助法进行粗提［6-8］，同时利用植物多糖难溶于高浓度乙醇，采用水溶醇沉法对多糖提纯，并确定其纯度［9-10］。本文采用溶剂浸提法，并应用响应面法优化爬山虎落叶中多糖的提取工艺，以期对爬山虎落叶中多糖资源的综合利用提供试验依据。

1 试验

1.1 原料预处理

爬山虎落叶除去表面的浮尘、烘干、粉碎粒径小于0.178 mm，备用。

1.2 浸提实验

取5 g预处理原料，加入一定量的浸提剂，在一定温度下静置浸提一定时间后过滤，取滤液蒸出溶剂，即得多糖提取物。

1.3 多糖含量的测定

1.3.1 苯酚-硫酸-分光光度法定量测定多糖从质量浓度为160 μg/mL的蔗糖标准溶液中分别吸取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL置于10 mL容量瓶中，加蒸馏水补齐至4 mL，再分别加入50 g/L的苯酚1 mL和浓硫酸5 mL，混匀，静置20 min。用722s可见分光光度计，在490 nm波长下测吸光度，拟合得到蔗糖标准曲线方程为

式中：A为吸光度；C为测试液体质量浓度，μg/mL。

1.3.2 爬山虎落叶中多糖含量测定 准确量取滤液体积V（mL），将滤液配制成适当质量浓度的多糖溶液，准确吸取样品液1 mL于10 mL容量瓶，测吸光度。根据式（1）计算多糖浓度C（g/mL）。多糖提取率Y计算式

式中：m为爬山虎干叶质量，g。

2 结果与讨论

2.1 单因素影响水平优选

单因素法考察影响多糖提取率的4个因素：浸提时间、浸提温度、浸提剂乙醇体积分数和液料比，实验结果如图1所示。

随着提取时间的延长和溶剂乙醇体积分数的增加，多糖提取率都先增加后减少，出现极大值。因为随着提取时间的延长，落叶中溶解速率慢的组分也有了大量的溶解，对多糖的检测产生了影响。多糖不溶于乙醇，随着乙醇含量的增加，多糖在溶液中的溶解度减小，所以滤液中检测到的多糖量减少。

随着提取温度的升高多糖提取率先快速增加，后缓慢增加。因为温度升高可以提高分子的扩散速率，相同时间内提高提取率。

随液料比的增加，多糖提取率先快速增加，后趋于不变。这是因为在原料中含有的多糖量是确定的，在多糖没有被最大量提取之前，溶剂量增加，可溶解的多糖增加，提取率也增大，但当原料中的多糖最大量提取之后，再增加溶剂，提取率则不再增加。

图1 单因素对提取率的影响Fig.1 Effects of single factor on extraction rate

所以单因素优选工艺：提取时间为120 min，提取温度不宜超过100℃，液料比10 mL：1 g，乙醇体积分数40%。

2.2 多糖提取物的提纯

对滤液浓缩干燥，放入少量水溶解完全，加入两倍体积的无水乙醇进行醇沉提纯，静置过夜后过滤，滤饼干燥得到多糖。重复上述提纯过程4次，分别测定醇沉后多糖纯度。

提纯次数对多糖纯度的影响曲线见图2。在提纯2次时，纯度达到最大33.56%，相较于第一次纯度提高了17.63%，继续增加提纯次数，纯度几乎不变。为了提高效率，对多糖提纯2次即可。

图2 提纯次数对多糖纯度的影响Fig.2 Effects of purification times on polysaccharides purity

2.3 响应曲面优化多糖提取工艺

以单因素实验结果为依据，在乙醇体积分数为40%，提取次数为一次，根据提取温度、提取时间、液料比3个单因素为自变量进行组合优化。3个因素及每个因素的水平见表1。为讨论以上各因素协同作用对提取率的影响，采用Disign-Expert 8.0.6软件中的Box-Behnken Design（BBD）实验方法设计了三因素共17个实验点的响应面试验，详见表2。

表1 Box-Behnken Design实验因素和水平Tab.1 Experimental factors and levels of Box-Behnken Design

利用Design-Expert 8.0.6分析数据，对提取率Y构建多项式多元线性回归方程

Y=4.90+0.11A+0.40B+0.41C-0.17AB+

数值模型方差分析结果见表3。P值作为检测影响因素显著性的一个指标，P值越小，表明对应的因变量影响越大。**表示极显著。

表2 BBD实验设计与结果Tab.2 BBD experimental design and results

表3 提取率模型方差分析Tab.3 Variance analysis for extraction rate

模型F值为19.29，P值为0.0004，意味着模型是极显著的。失拟项的P值为0.23＞0.1，说明失拟项不显著。该回归模型决定系数R2=0.961 2，说明该模型能解释96.12%的数值，拟合程度较好，实验误差较小，因此该回归模型成立。模型一次项B、C影响是显著的（P＜0.1），互顶项A2、B2、C2影响也是显著的（P＜0.1）。在这种情况下，C2的P值远远小于其他互顶项，故C2是考虑提取率的极重要的模型项。其他交互顶项对提取率的影响不显著，表明这几个因素无交互作用。在所选的各因素水平范围内比较P值，按照对提取率影响显著性的大小排列为液料比C＞提取时间B＞提取温度A。

利用Design-Expert 8.0.6软件解析各因素交互影响的响应面及等高线，结果如图3所示。通过对比，得到三个因素对提取率的影响顺序：液料比C＞提取时间B＞提取温度A。这与方差分析结果相符合。综合考虑和权衡指标后，对回归方程进行求解，得到模型最佳解为提取温度为51℃，提取时间为2.5 h，液料比为16 mL：1 g，模型预测值提取率Y=4.99%。

在此条件下做5组平行实验，计算多糖的平均提取率为4.92%，与预测值的相对误差为1.4%，实验值与模型预测值拟合性良好。

3 结论

实验研究证明了爬山虎落叶中含有多糖，采用水-乙醇双溶剂最大提取率为4.92%。单因素考察了影响多糖浸提率的因素和水平；响应面法优化得到最佳提取工艺参数：提取温度51℃，提取时间2.5 h，液料比16 mL：1 g，模型预测的多糖提取率Y=4.99%；影响多糖提取率的各因素显著性大小为：液料比＞提取时间＞提取温度。无水乙醇对多糖提取物有纯化作用，2次醇沉即可达到纯度最大33.56%。

图3 各因素交互影响的响应面和等高线Fig.3 Response surfaces and contour lines under interactive influence of various factors