环境因子对克氏原螯虾Procambarus clarkii 免疫指标影响的研究进展

舒斌，李军涛，张秀霞，冼健安，周小云，王冬梅

（1.华中农业大学水产学院，湖北 武汉 430070；2.中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南 海口 571101；3.海南省海洋生物资源功能性成分研究与利用重点实验室，海南 海口 571101）

克氏原螯虾Procambarus clarkia（俗称淡水小龙虾）原产于墨西哥东北部和美国中南部，引入到日本后20 世纪30 年代由日本传入我国。我国克氏原螯虾养殖业发展迅猛，消费市场持续扩大，产业链不断延伸，逐步形成了苗种繁殖、养殖加工、餐饮文化为一体的产业链。随着养殖强度的不断增大、水质不良，克氏原螯虾的免疫功能下降，病害频繁，制约了产业的健康发展。本文通过综述环境因子对克氏原螯虾生理生化免疫指标的影响，以期为克氏原螯虾高效健康养殖提供参考，为进一步开展相关研究提供理论依据。

1 氨氮对克氏原螯虾的影响

氨氮是影响克氏原螯虾自身免疫功能的重要环境因子之一。在养殖水体中，氨氮主要来源于水产动物排泄的粪便以及水体中含氮残饵的氨化作用，随着养殖时间的延长，氨氮会不断积累[1]。氨氮是NH4+（离子氨）和NH3（非离子氨）总和的统称，NH3比NH4+对甲壳类动物的毒性更强，更容易跨越脂质双分子层，例如水生动物的鳃丝和血液等。研究表明，氨氮首先损伤虾类的鳃丝组织，降低其呼吸频率，进一步渗透到血液中阻碍携氧能力，最终导致虾类中毒或缺氧死亡[2]。

水体中离子氨和非离子氨的比例与水温、pH以及盐度有关。急性毒性试验表明，氨氮对克氏原螯虾幼虾的96hLC50（半致死浓度）为79.4mg·L-1[3]；对凡纳滨对虾[4]Litopenaeus vannamei 幼虾和罗氏沼虾[5]Macrobrachium rosenbergii 幼虾的96hLC50分别为5.42mg·L-1和19.3mg·L-1，克氏原螯虾幼虾对氨氮的耐受力较强，对一定浓度范围内，对氨氮具有自我调节能力，随着浓度增加，毒性作用增强，对幼虾组织器官破坏性更大，死亡率增高[3]。芦光宇等[6]研究了不同浓度氨氮和作用时间对克氏原螯虾免疫指标的影响。结果显示，随着时间的推移，所有处理组（除0mg/L 组外）肝胰腺中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）的活性均先升高后降低。10mg·L-1、20mg·L-1组SOD 活性分别在第48h 和第36h 后下降，与对照组无显著差异；30mg·L-1、40mg·L-1组SOD 活性均在36h 后下降，50mg·L-1组SOD活性在24 h 下降，三组均显著低于对照组；10mg·L-1、20mg·L-1、30mg·L-1组CAT 活性在36h 无显著差异，40mg·L-1和50mg·L-1组CAT 活性在24h 无差别，36h 显著低于对照组；10mg·L-1组螯虾肝胰腺中丙二醛（MDA）含量先上升，显著高于对照组，在48 h 下降至与对照组无显著差异，20～50mg·L-1组先上升后略微下降，但MDA 含量始终显著高于对照组。说明氨氮胁迫开始时，螯虾产生大量氧自由基，机体通过调节产生更多的SOD 和CAT 消除多余的氧自由基，但随着氨氮浓度的升高，产生的氧自由基超出了机体清除能力，导致抗氧化能力减弱。刘振兴[7]研究发现，在5mg·L-1NH+4-N（铵态氮）胁迫1～96h 期间，克氏原螯虾血细胞总数（THCs）和酚氧化酶（PO）、SOD 活性以及鳃丝Na+-K+-ATPase活性均先上升后降低，在15 mg·L-1、30 mg·L-1和50 mg·L-1组这些免疫指标均被抑制。综上所述，克氏原螯虾抵抗氨氮胁迫有一定范围，在一定的低浓度下，氨氮的胁迫会迅速激活虾体相关抗氧化酶的活性，消除胁迫产生的大量活性氧自由基，而长时间高浓度的氨氮可能会损伤虾体组织器官，破坏免疫系统，生理生化指标出现下降。

2 亚硝酸盐对克氏原螯虾的影响

亚硝酸盐也是克氏原螯虾重要的环境胁迫因子之一，亚硝酸盐过高往往能引发虾类发生一系列的疾病。水体中的硝化细菌通过硝化作用将NH+4（铵根离子）氧化或者通过硝酸盐反硝化作用还原成亚硝酸盐。亚硝酸盐毒性很强，能抑制一些抗氧化酶的活性，导致虾类组织器官的病变。钟君伟等[8]研究发现，以12.32mg·L-1，并进一步12mg·L-1的亚硝酸盐氮胁迫处理体质量（9.32±1.57）g 的克氏原螯虾，24 h 后肝胰腺中SOD 活性迅速降低（P＜0.05），明显低于对照组（0mg·L-1），且随时间延长SOD 活性抑制程度更大（P＜0.05），72h 抑制程度最高为37.77%，CAT 活性在胁迫12h 就迅速降低（P＜0.05），24h 时抑制程度达到最高。综上所述，亚硝酸盐能影响克氏原螯虾的免疫功能，CAT 对亚硝酸盐胁迫时的反应迅速，比SOD 更加敏感，更早地受到抑制。6 组不同浓度亚硝酸盐对克氏原螯虾胁迫后，不同时间取肝胰腺检测，发现SOD、CAT 活性和MDA 含量随时间延长先上升后下降；选取同个时间点检测不同浓度梯度的亚硝酸盐，肝胰腺中SOD 和CAT 活性随亚硝酸氮浓度升高先上升后下降，而MDA 含量均逐渐上升[9]。亚硝酸盐能进入甲壳动物血淋巴中将氧合血蓝蛋白转化成脱氧血蓝蛋白，使其失去运输氧气的功能，导致动物缺氧死亡。目前关于亚硝酸盐对甲壳动物血蓝蛋白研究较少。对日本沼虾Macrobranchium nipponense 的研究发现，随亚硝酸盐质量浓度增加，血淋巴中血蓝蛋白含量先上升后下降，2.0 mg·L-1时血蓝蛋白含量最高，与对照组差异显著（P＜0.05），随浓度增加，降低到与对照组无显著差异[10]。

3 pH 对克氏原螯虾的影响

pH 变化对水生动物、浮游植物以及底栖动物的生长发育也有直接或者间接的影响。倪静静等[11]研究了pH5.5、6.5、纯水（对照组6.7）、7.5 和8.0 对克氏原螯虾的影响，发现pH5.5 和pH8.0 下克氏原螯虾在一周内死亡率较多。幼虾对pH 变化的耐受力比成虾更低[12，13]。Na+-K+-ATPase 对外界环境的变化很敏感，可以作为衡量甲壳动物生理状况的指标[14]。研究发现，pH5.0 和pH9.0 时，克氏原螯虾鳃组织Na+-K+-ATPase 活力显著低于对照组（pH7.0），而pH 9.0 组该酶的活力显著高于pH5.0，说明酸性条件下碱性对克氏原螯虾酶活力的抑制作用更强[15]。这是由于鳃上皮细胞顶部膜上的Na+/H+体系，在H+浓度过高时，吸收外界Na+能力下降，导致与交换体系偶联的Na+-K+-ATPase 活性降低[16]。熊传喜等[17]发现，在pH3.0～7.0 时克氏原螯虾PO 活性随pH 升高而增加，当pH＞7 后，酶活力随pH 升高而降低，血清PO 在pH6.0 和7.0 的缓冲体系中稳定性较强，在30℃下保温30 min 后PO 活力仍然保持原活力的96%和81%。朱毅菲[18]研究了低pH2.0、4.0、6.0对克氏原螯虾免疫功能的影响。结果表明，持续酸性溶液作用下，螯虾肝胰脏和肌肉溶菌酶（LSZ）、PO、SOD、THCs 以及螯虾对金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus 的吞噬活性和清除效率下降趋势明显，低pH 的酸性溶液能使克氏原螯虾的免疫能力显著下降（P＜0.05），建议克氏原螯虾养殖水体的pH 维持在6.0 以上。陶易凡等[19]用高pH10.2胁迫克氏原螯虾96h 后，发现鳃丝Na+-K+-ATPase活性呈上升趋势，8 h 后与对照组（pH7.6）差异显著，肝胰腺中CAT 活性先上升后下降，SOD 活性初始没有明显变化，24h 后明显下降；低pH3.6 在96h期间，克氏原螯虾鳃丝Na+-K+-ATPase 活性上升，2h 内与对照组（pH7.6）无差异，胁迫8h 后显著高于对照组；胁迫2h SOD 活性与对照组差异显著，8h 活力达到最大随后下降，96h 后显著低于对照组，CAT活性呈先上升后下降的趋势，但变化规律与SOD 不同步，胁迫2h 后CAT 活性与对照组无差异，8h 才开始显著高于对照组，96h 后试验组CAT 活力与对照组差异不显著[20]。综上所述，当pH 突变克氏原螯虾通过鳃丝Na+-K+-ATPase 活性上升调节自身渗透适应力，维持体内离子平衡。pH 刺激使鳃组织离子通透性异常，Na+-K+-ATPase 活性上升有助于维持鳃的离子交换平衡；肝胰腺抗氧化能力的SOD 和CAT 活性一开始上升，可能是由于pH 的刺激导致螯虾体内活性氧自由基的大量产生，激活了机体抗氧化酶的活力，加速了清理自由基的能力，后期活性氧自由基过度累积，超出了抗氧化系统的清理能力，细胞受到氧化损伤，抑制了肝胰腺抗氧化功能。

4 溶解氧对克氏原螯虾的影响

氧气是水生生物生存的必要条件，虾池中溶解氧含量直接影响螯虾呼吸频率和代谢强度。病原、环境、养殖对象相互作用和影响共同决定是否爆发疾病。溶解氧对三者的影响非常重要，充足的溶解氧能够优化水质减少病原生物，提高水生动物的免疫力。低溶解氧量已经成为螯虾发病的重要诱因之一。随着水体中溶解氧含量的降低，甲壳动物THCs不断下降，对病原的易感性增强[21]。窒息点是水生动物窒息临界含氧量，是所能忍受低氧的下限指标。克氏原螯虾窒息点可低至0.061 mg·L-1[22]，罗氏沼虾窒息点最低为0.960 mg·L-1[23]，南美白对虾窒息点最低为0.666 mg·L-1[24]。克氏原螯虾对水体低溶解氧量的耐受能力比较强。为了探究溶解氧量对罗氏沼虾免疫能力的影响，Cheng 等研究发现，罗氏沼虾在低溶解氧情况下THCs 下降、PO 活力降低，对肠球菌Enterococcus 的吞噬能力和清除能力也显著减弱[25]。中国明对虾Fenneropenaeus chinensis 在2.0 mg·L-1低溶氧胁迫下具有一定耐受性和调节能力，在6h 和12h 对虾血浆和肌肉中乳酸含量显著增加，24h 后降到对照组水平，对鳃及肝胰脏中抗超氧阴离子活力以及MDA 无显著影响[26]。凡纳滨对虾在低溶解氧含量下血浆PO 活力在0～12h 内呈上升趋势，12h 后趋于稳定，且溶解氧含量越低酶活力越高，鳃丝Na+-K+-ATPase 活力在0～12h 内呈升高趋势，12h 酶活力最大，溶解氧含量越低酶活力越高，此后开始下降，48h 后趋于稳定，稳定后与对照无显著差异[27]。水体溶解氧对克氏原螯虾免疫功能、生理生化指标的影响报道较少，有待深入研究。

5 温度对克氏原螯虾的影响

克氏原螯虾的最适生长温度为21～28℃，水温12℃以下停止摄食，超过30℃钻进洞穴[28]。生产中发现，水温的剧烈变化是引起螯虾死亡的重要因素。熊传喜等[17]发现，在20～70℃范围内，克氏原螯虾血清PO 酶活力的最适温度为20℃，随温度升高酶活力迅速下降，20～40℃时PO 活力较为稳定。水生动物Na+-K+-ATPase 对温度较敏感，能在短时间内迅速对不良环境起免疫应答反应。郭春雨等[15]发现，在15℃、20℃和30℃下，克氏原螯虾鳃丝Na+-K+-ATPase 活力随温度升高而升高，在温度突变后的短时间内该酶活力迅速上升，表现出很强的应激反应，4h 后酶的比活力逐渐下降，适应新的温度。温度通过直接影响生物膜结构来影响虾鳃丝的Na+-K+-ATPase 活力，膜上构象的转变和酶对底物亲和力的提高，使鳃丝Na+-K+-ATPase 对血淋巴渗透压调节的能力加强[29]。说明克氏原螯虾对温度的变化在一定范围内具有自我调节的功能，在温度胁迫下能迅速作出防御反应。酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（AKP）参与甲壳动物的磷酸基团代谢和转运，能够形成水解酶，清除入侵机体的异物[30，31]。王天神等[32]研究发现，在水温10～15℃时，克氏原螯虾血液中ACP、AKP 活性稳定，20℃两者活性达到最大值，随着水温继续升高活性逐渐下降；CAT 活性在10～30℃随温度升高逐渐降低，10℃时活性最高，30℃时最低；SOD 活性在10℃最低，在10～30℃范围内随着温度升高逐渐上升，30℃时达最高活性（138.31U·mL-1）。根据以上研究，在克氏原螯虾养殖过程中，一定要注意水体温度的变化，尤其是7、8月份，保持一定的水深，有利于螯虾自身对水温变化的调节。

6 重金属离子对克氏原螯虾的影响

工业废水、农用化肥中往往存在的重金属离子在克氏原螯虾体内蓄积，损伤机体各个组织。研究发现克氏原螯虾经过20d 的5 mg·L-1Cu2+、0.1mg·L-1Cd2+胁迫后，SOD 活性显著低于对照组（P＜0.05），在各组织器官中SOD 活性由高到低顺序为：肌肉＞鳃＞肝[33]。这种差异可能与重金属离子在不同组织器官中富集能力不同有关。Cu2+在水生甲壳动物体内承担着重要的生理作用，可以作为辅酶因子调节铜依赖酶的活性，也是合成血蓝蛋白的必须物质[34]。但随着Cu2+浓度上升，会诱导机体产生大量活性氧自由基[35]。张娟等[36]发现，在0 mg·L-1（对照组）、1 mg·L-1、3 mg·L-1、5 mg·L-1和10 mg·L-1Cu2+胁迫下，随时间延长，各试验组克氏原螯虾THCs 明显下降（P＜0.05），10 mg·L-1Cu2+组THCs 下降尤为显著；与对照组相比PO 活性也均受到显著抑制（P＜0.05），随暴露时间延长1 mg·L-1和3 mg·L-1Cu2+试验组PO 活性逐渐下降，5 mg·L-1和10 mg·L-1组活性逐渐上升，胁迫96 h 后，低浓度组（1 mg·L-1和3 mg·L-1）比高浓度组（5 mg·L-1和10 mg·L-1）影响更显著。血蓝蛋白是一种含Cu2+呼吸蛋白，结构与PO 极其相似，在一定条件下可表现出PO 活性，提高机体的抗氧化功能。张娟[37]发现，1 mg·L-1组胁迫24 h，克氏原螯虾血蓝蛋白含量显著高于对照组，当Cu2+浓度高于3.0 mg·L-1时，血蓝蛋白含量均低于对照组；将克氏原螯虾暴露在0 mg·L-1、0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、3.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1和10.0 mg·L-1Cu2+溶液中发现，螯虾血淋巴ROS（活性氧）先上升后被抑制[38]。这可能是重金属Cu2+胁迫会导致螯虾产生氧化应激，ROS 含量过高，机体抗氧化酶活性降低，螯虾就更容易死亡。

7 病原对克氏原螯虾的影响

环境因子中病原和药物对克氏原螯虾的生长及免疫功能有重要影响。嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila 普遍存在各种水体中，是养殖水体环境中主要致病菌之一。给克氏原螯虾注射0.1 mL 浓度为1.5×104cfu·mL-1、1.5×106cfu·mL-1嗜水气单胞菌作后，THCs 含量和SOD 活性均先降低后上升，低浓度组在1～96h 溶菌活性、抗菌活性、PO 活性均先上升后降低，高浓度组溶菌活性、抗菌活性、PO 活性则被抑制，均先降低后上升，但仍低于对照组[39]。作为细菌败血症病原的嗜水气单胞菌，一旦感染，将引起克氏原螯虾免疫功能下降，因此要合理控制密度健康养殖。李贺水等[40]以胰蛋白酶作诱导剂，激活酚氧化酶原，发挥PO 活力，发现在大肠杆菌注射试验中无论是否加胰蛋白酶，试验组与对照组血细胞PO 活力均无明显差异；在嗜水气单胞菌注射实验中，无论是否加胰蛋白酶，肝胰脏和血细胞PO活力在12h、24h、48h 显著高于对照组。可见克氏原螯虾对致病菌嗜水气单胞菌与非致病菌大肠杆菌免疫作用机制有差别。感染大肠杆菌后，血细胞中含有的结节结构能够阻挡病原入侵，而感染嗜水气单胞菌后没有类似的免疫反应，病原菌入侵机体，导致死亡率增加[41]。用0.1mL 白斑综合症病毒（WSSV）感染克氏原螯虾12～24 h 后，PO 活力显著高于对照组（0.1mL PBS 缓冲液），48h 极显著高于对照组（P＜0.01），72 h 恢复至对照组水平[40]。由此可以推测，PO 参与了克氏原螯虾抵御WSSV 的免疫，但其作用机理还有待进一步研究。

8 研究与展望

近几年，克氏原螯虾产业链的火爆促进了该产业的发展，但是，病害的频发制约了克氏原螯虾的产量。甲壳动物主要通过先天性非特异性免疫系统来抵抗外来入侵异物，研究环境因子对克氏原螯虾的影响，有利于研究病害发生的机理，为研制克氏原螯虾抗应激作用的免疫增强剂提供新的思路。有关克氏原螯虾的研究需进一步开展：

（1）深入探究克氏原螯虾先天性非特异性免疫机制，从基因的角度上研究环境因子对克氏原螯虾免疫功能的变化。

（2）结合环境因子对克氏原螯虾的影响，制定一套高效可行的方案来评价健康虾苗，同时开发绿色高效的免疫增强剂，从幼苗开始就提高克氏原螯虾自身免疫力。

（3）深入探究环境因子、病原感染途径与克氏原螯虾三者之间的关系，结合生产实际，提高养殖产量增加创收。

（4）从单一到整体研究克氏原螯虾对几种环境因子免疫机制的应答，深入了解它们之间的内在关系。