中国白酒酿造微生态学研究技术进展及应用状况

高占争，张文学，吴正云

（1.四川大学轻工科学与工程学院，四川成都 610065；2.四川水井坊股份有限公司，四川成都 610037）

1 白酒微生态学的简介

微生物生态学认为，微生态系统是在一定的时间空间内微生物种群之间，以及它们与生境之间，不断地进行物质循环、能量流动和信息传递而形成的统一整体。而中国白酒酿造系统中的大曲、窖泥、糟醅及酿造环境都是一个微生态系统，而这些小的微生态系统又构成了白酒酿造微生态系统。由此，国内专家学者开始以微生态学的观点来研究白酒酿造微生态系统。四川大学的张文学教授等[1-2]结合微生态学和白酒酿造的特点，把白酒酿造微生态学定义为：研究白酒酿造过程中微生物菌群与微观酿造环境之间相互关系的科学；研究内容包括白酒制曲、窖池、酒醅和发酵环境中的微生物菌群以及微观环境之间的相互关系。白酒酿造微生态的概念提出后，很快得到了行业内专家学者的认同，同时白酒酿造微生态学也得到了快速发展。根据SCI 收录的关于白酒微生物多样性的文章可以明显看出这种趋势，2007年到2010 年每年只有一篇文章，2011 年到2013 年每年有4～6 篇文章，而2014 年有14 篇，2015 年有12 篇，2016 年1～6 月已有6 篇文章。其中，早期的论文多数都是张文学教授团队的研究。除了白酒领域之外，张文学教授团队还把酿造微生态的研究引领到泡菜等其他发酵食品领域，促进了中国各类特色酿造发酵食品微生态学的发展。白酒酿造微生态学的快速发展离不开研究技术的支撑，特别是新的分子生物学技术层出不穷，有力地促进了白酒酿造微生态学的快速发展，在上面这些研究白酒酿造微生态的文章中，多数使用了分子生物学技术。因此有必要了解酿造微生态学研究技术的优缺点、应用现状和发展状况，以便促进白酒酿造微生态学的进一步发展，更有利于认识白酒酿造规律，促进白酒生产技术的改进。

2 中国古代及近现代对酿酒微生态的认识

中国的酿酒文化源远流长，在古代人们认为酿酒是神秘的现象，对酿酒微生物几乎没有科学的认识，但我国人民在长期的生产实践中不断地摸索、探索，在不知不觉中运用生态学的原理及方法进行酿酒。例如，我们自古以来就非常重视酿酒地理及生态环境，例如必须考虑酿酒当地的气候、土壤、水质等因素。

用曲酿酒，是我国祖先在酿酒科技史上的一大发明，是中国酿酒工艺独一无二的特点。曲药酿酒技术就体现了人们对酿酒微生态的一些初步认识。在《齐民要术·造神曲并酒》[3]中记载：“造酒法：……一斗曲用水一斗五升，十月桑落，初冻，则收水酿者为上时春酒；正月晦日收水，为中时春酒；初冻后，尽年暮，水脉既定，收取则用。其春酒及余月，皆须煮水为五沸汤，待冷，浸曲。不然则动。”这段话体现的是中国黄酒传统酿造的技术措施之一，巧妙地利用了气温的变化和热水杀菌。冬季气温低，杂菌少，烧水也可以杀灭杂菌，这都有利于酿酒功能微生物群落的生长繁殖，有利于酿造优质酒。对微生态的认识在制曲方面也有体现，例如选择制曲原料不必墨守陈规，可以因地制宜，制曲季节要适时，踩曲松紧度要适度，曲坯包裹要严密、要注意通风保温等等。这都是为了富集有益微生物群落，尽量减少杂菌。

3 白酒酿造微生态研究的近现代技术

中国虽然酿酒历史悠久，在早期对酿造微生态也有一些初步认识，但是对酿造微生态真正的认识和利用还是从近代科学技术的出现开始的。

随着荷兰人Leeuwenhoek 发明制造出显微镜，直接观察到微生物的形态，人们对微生物首次有了直接的认识。1910 年又一里程碑技术——微生物平板纯培养技术的出现，把微生物技术推向一个新高度，有力地促进了微生物学的发展[1]。后来抗生素的出现、无菌动物饲养和厌氧技术的发展促使微生物学和相关技术的快速发展，也促使微生态学作为生态学的一个学科分支出现。

这一时期主要应用显微镜和微生物平板纯培养法研究酿酒微生物。微生物平板纯培养法[4]是根据特定的，具有明显特点的微生物选择相应的培养基，分离进行纯培养，对纯种微生物通过显微镜观察形态，然后再根据生理生化特征等方面进行分析鉴定。这是传统的微生物多样性研究方法，只适用于可培养微生物，微生物态中还有绝大部分的未培养微生物，因此无法真正了解微生态的整体。

我国对酿酒微生态的认识也是随着这些技术的发展逐步深入的。1931 年，我国黄海化学工业研究社查明了各地高粱曲中的微生物[3]，首次分离出多种丝状真菌和酵母，主要有华根霉、东京根霉、李克犁头霉、鲁氏酵母、酿酒酵母等。这一研究促进了人们对大曲微生物的科学认识和利用。解放后我国加大了对白酒的研究力度，分离出很多纯种微生物，例如大曲中的红曲霉、窖泥中的己酸菌等[5]。这一时期主要是利用微生物纯培养技术分离出酿酒主要菌种，然后再研究利用这些菌种提高原料利用率、岀酒率等。中国白酒酿造环境中微生物种类丰富，种群复杂，传统的平板纯培养技术无法分离和分析更多的微生物，更无法研究酿酒微生物菌群之间的相互作用。所以这一时期注重的是单个微生物的分离、培养和应用，虽然对酿酒微生物和酿酒环境有了更深入的认识，但受技术条件限制无法充分认识和利用酿酒微生态。

4 近年白酒微生态学研究技术的发展及应用

近年来分子生物学相关技术的快速发展有力地促进了白酒微生态学和研究技术的发展。目前白酒微生态学研究中除传统的微生物分析方法外，还用到一些生态学研究常用技术，例如磷脂脂肪酸分析方法（PLFA），而用到的最主要的技术为分子生物学技术，如基于PCR 的指纹图谱分析、基因测序及系统发育分析、克隆文库、荧光原位杂交技术（FISH）、宏基因组学、蛋白组学、代谢组学等。

4.1 基于PCR 的指纹图谱分析技术

现在白酒酿造微生态研究中最常用的技术就是基于PCR 的指纹图谱分析技术，主要有DGGE（变性梯度凝胶电泳，Denaturing gradient gel electrophoresis）、SSCP（单链构象多态性，Single strand conformation polymorphism）、RFLP（限制性片段长度多态性，Restriction fragment length polymorphism）等。在这些技术中使用最多的是PCR-DGGE 技术，此外DGGE 分析技术还可以与实时定量PCR（quantitative real-time PCR）、DNA 芯片、巢式PCR（Nested PCR）等技术相结合分析白酒酿造微生物的多样性。

PCR-DGGE 技术[6-7]首先分离纯化环境样品DNA，再用通用引物PCR 扩增核糖体核糖核酸的部分序列，原核生物一般是16S rRNA/16S rDNA 的V3、V4、V5 区，真核生物18S rRNA/18S rDNA 的V4 区以及ITS 序列，然后进行DGGE 分析。再通过DGGE 优势条带的切胶回收、测序、鉴定，获取微生物种群结构信息。

在白酒酿造微生态的研究中，以PCR-DGGE技术为主并结合其他技术在窖泥、糟醅、大曲的微生物多样性研究中均有广泛应用。Liang 等[8]为了区分成熟窖泥和退化窖泥，用PCR-DGGE 和qPCR技术比较分析不同地区中国浓香型白酒成熟窖泥与退化窖泥中细菌群落。此作者还用同样的技术分析了新窖泥和成熟窖泥的细菌群落结构[9]。Liu等[10]用DGGE 技术分析了中国浓香型白酒窖泥（窖龄分别为1 年、50 年、100 年、400 年）中梭菌I 的多样性。Deng 等[11]用PCR-DGGE 方法分析不同窖龄窖泥微生物群落。Ding 等[12]用PCR-DGGE 与FISH 结合分析人工窖泥中的古细菌和真细菌群落特征。Wang 等[13-14]从不同大曲中提取DNA 用于PCR 扩增，使用16S rRNA,26S rRNA 和18S rRNA的通用引物，扩增后分别用DGGE 方法分析，研究了清香型大曲的微生物多样性。Xiong 等[15]用PCR-DGGE 方法系统研究了3 种大曲（机制大曲、手工、混合制曲）中细菌、芽孢杆菌、真菌、酵母群落。Du 等[16]用PCR 扩增放线菌rDNA，然后用DGGE 方法分析了大曲培养过程中链霉菌的生态情况，结果表明，大曲培养过程中链霉菌广泛存在。

之所以基于PCR 的DGGE 应用这么广泛，是因为其有突出优点[17-18]：可以快速、简便通过DGGE 图谱来检测和鉴定微生物种类。但是还有一些技术缺陷，需要进一步改进[17-18]，主要缺陷有：①检出信息量低，难以建立系统发育树；② 很难检出微生物总量低的微生物(＜1%)；③有共迁移现象，而且影响结果的因素比较多，例如DNA 提取分离效果、凝胶浓度、PCR 扩增效率、电泳时间等。

针对PCR-DGGE 的一些弱点，也有改进的方法，例如NestedPCR-DGGE[17]，通过特殊引物的两次扩增，既增加了检测的灵敏性，又增加了检测的可靠性。Wang 等[19]从3 个发酵糟醅和12 个环境因子中提取总DNA，包括糟醅、大曲、窖泥、土壤、空气、高粱，然后扩增16S 和18S rRNA 基因，用Nested PCR-DGGE 分析典型微生物的分布。同时用16S rRNA 和内转录间隔区（ITS）的qPCR 扩增评估样品中微生物丰度。Ding 等[20]用NestedPCR-DGGE 方法调查和比较了浓香型白酒窖池窖壁和窖底窖泥中古细菌和真菌群落结构。Zhang 等[21]用NestedPCR-DGGE 分析大曲微生物群落特征。

除了使用PCR-DGGE 技术，还有一些研究者利用基于PCR 指纹图谱分析的其他技术，例如Chen 等[22]优化了PCR-SSCP 分析条件，然后用于浓香型白酒发酵微生物多样性分析。Hai 等[23]利用PCR-SSCP研究河套酒大曲细菌群落特征。Liu等[24]用实时定量PCR 研究了中国浓香型白酒窖泥中Syntrophomonadaceae 类菌的发展现状，研究结果表明，此方法快速、灵活、准确，针对性强、灵敏度高。定量结果可以进一步了解Syntrophomonadaceae 在窖泥中不同时间和空间的分布。Wei 等[25]用荧光实时PCR 定量不同窖龄窖泥（3 年、13 年、25年）中的微生物的数量。

4.2 基因测序分析及克隆文库技术

DNA 序列分析方法是利用已有的许多功能基因及专门的rDNA 序列数据库软件，进行序列比较，揭示更高水平的多态性。大多数DNA 多样性的研究以核糖体RNA（rRNA）或其编码基因rDNA为对象，利用其中的16S rRNA/rDNA 或18S rRNA/rDNA 序列信息的保守区和变异区，区分微生物种差异[1，26，27]。

在白酒的微生态研究中也主要是利用16S rRNA/rDNA 或18S rRNA/rDNA 序列信息进行微生物多样性研究。例如王涛等[28]基于16S rRNA 的基因序列分析研究了宜宾地区浓香型大曲酒酿造过程中可培养细菌系统发育多样性。Zhang 等[29]用DGGE 方法和18S rRNA 基因分析方法研究分析了中国浓香型白酒酿造过程中糟醅的真菌群落。Chen 等[22]用PCR 扩增的片段为16S rDNA 的V3 区研究发酵糟醅的微生物群落。Liang 等[30]用基于16S rRNA 基因的V3 区鉴定大曲中细菌。Zheng等[31]分析16S rDNA 的V9 区，研究大曲制曲过程中芽孢杆菌群落。Deng 等[11]分析16S rDNA 的v6 到V8 区，研究不同时期浓香型酒窖池窖泥的微生物群落。除了以上对16S rRNA/rDNA 或18S rRNA/rDNA 序列分析研究，还有专家学者利用其他的一些基因序列进行微生物多样性的研究。Sun 等[32]分析26S rDNA D1/D2 分区的序列，对茅台酒不同酿造阶段的酵母进行鉴定。Xiang 等[33-34]基于SSU rRNA 免培养技术，研究了中国浓香型酒酿造过程中发酵糟微生物群落的演替。

克隆文库技术是以PCR 技术为基础，并与基因测序技术相结合，经常用于环境微生态的研究。其基本过程[35-37]是先提取样本DNA，然后用通用引物进行PCR 扩增，回收纯化扩增产物、构建克隆文库、测序分析、构建系统发育树，最后推测复杂环境微生物群落的分类学地位。此技术在白酒微生态研究中也有较多使用。例如陈玲等[35]用16S rDNA 克隆文库法和高通量测序法，分析了浓香型白酒大曲中细菌微生物群落的组成，并通过丰度和多样性分析，比较了两种方法在研究大曲样品细菌多样性方面的适用性。Zheng 等[38]利用16S rRNA 和26S rRNA 基因克隆文库分析不同大曲中微生物群落特征。王涛等[39]利用16S rRNA 基因克隆文库，分析了浓香型白酒窖泥、出窖糟醅的细菌区系的相似性。王明跃等[40]用PCR-ARDRA和16S rRNA 基因克隆测序技术，对四川和安徽产区窖泥细菌和古菌进行了研究。克隆文库技术，技术成熟，可操作性好。但其操作步骤较为繁琐，工作量较大，反映总体微生物信息有限，并有可能在一定程度上高估物种丰度及低估微生物群落大小和多样性。但如果主要以优势菌群的认识研究为主，不看重极低丰度菌群的存在，不失为一种很好的酿造微生态学研究方法。

4.3 磷脂脂肪酸分析方法（PLFA）及荧光原位杂交技术（FISH）

磷脂脂肪酸分析方法[41-42]是基于细胞中磷脂类化合物相对稳定作为微生物生物量指标，磷脂类化合物中脂肪酸组成特异性和多态性能反映环境中微生物群落结构的多样性。此方法能够依靠脂肪酸谱图定量描述整个微生物群落,是一种快捷、可靠的检测方法，但它不能在菌种和菌株的水平鉴别出微生物的种类。此外，微生物在不同的生长时期以及环境压力下的磷脂脂肪酸的含量会有所变化，也会给监测带来困难。

磷脂脂肪酸分析方法是生态学研究中的一种常用方法，近年在白酒微生态研究中也有较多应用。Zhang 等[43]用PLFA 方法分析3 种汾酒大曲的微生物群落，此方法可潜在用于各种曲的代表性生物标记。Zheng 等[44]利用非培养技术（PLFA、DGGE）对两个不同厂（剑南春和丰谷）糟醅的不同糟层（上、中、下层）细菌群落的空间分布进行研究。Wu 等[45]用PLFA 方法分析大曲微生物群落特征。Zhao 等[46]用磷脂脂肪酸分析方法研究了不同窖龄窖池窖泥的菌群落结构。

荧光原位杂交技术[47-48]是dsDNA 变性后和带有互补序列的同源单链褪火配对形成双链DNA 或DNA/RNA 异质双链结构的过程，利用荧光标记的探针探测同源核酸序列。荧光原位杂交技术能够同时对微生物进行定性、定量和其群落结构进行研究，操作容易、安全、检测迅速，己广泛用于研究环境微生态和食品微生态。目前有人也开始用此技术研究白酒微生态，例如吴冬梅等[49]利用荧光原位杂交(FISH)技术，研究了窖泥微生物群落结构特征。Ding 等[12]结合PCR-DGGE 和荧光原位杂交(FISH)技术研究了浓香白酒窖池古生菌和真菌群落结构特征。

5 白酒酿造微生态研究的新技术

分子生物学快速发展，新技术不断涌现，例如新一代测序技术（高通量测序技术）、基因芯片技术、宏基因组学技术、生物信息学技术、代谢组学技术、蛋白质组学技术等。宏基因组学是以新一代测序和基因芯片技术为基础的，已经是比较成熟的组学技术，在环境微生物学研究中已有较广泛应用，在白酒酿造微生态学研究中也开始使用。其他的一些新技术虽然不够成熟，但随着这些技术的不断完善，将来肯定会成为白酒酿造微生态学研究中的重要常用技术。因此进一步了解这些新技术的发展状况，对白酒酿造微生态将来的发展非常重要。

宏基因组学[50]是指不依赖分离培养技术，直接分析菌群中微生物基因组序列和功能的方法。鉴于自然环境中约有99%的至今尚不能培养且一无所知的微生物存在，利用宏基因组学技术可以获得比培养方法多得多的遗传信息，为研究非培养微生物提供了有效手段。宏基因组学技术的基本步骤[51-52]是首先直接抽提环境微生物DNA，然后将DNA 片段克隆、转化，构建宏基因文库。利用高通量测序技术对文库进行随机DNA 序列测定，研究微生物群落组成，寻找特定的功能基因或表达的特殊表型。近年来，宏基因组学已逐渐成为微生物多样性研究的重要工具之一。

生物信息学技术的发展以及新一代测序技术有利地促进了宏基因组学技术的发展和完善。被称为深度测序技术(deep sequencing)的新一代测序技术（next generation sequencing，NGS）[53-56]，包括第二代及第三代测序技术，并且开始出现了第四代测序技术。目前第二代测序技术应用较为成熟，该技术基于聚合反应和连接反应，同时对大量DNA 分子平行测序，代表性平台有454 焦磷酸测序系统（Roche）、SOL iD 平台（Life Technologies）、Solexa 平台（Illumina）。第三代测序技术克服了二代技术的读长序列短、需要模板扩增步骤等缺点，以单分子测序和读长序列长为特点，目前已开始有一些应用。第四代测序技术以纳米孔测序为代表，采用物理方法直接读出其碱基序列，目前此技术尚处于实验阶段，无实际应用。在白酒酿造微生态研究中，应用最多是第二代测序技术中的焦磷酸测序，例如Zhang 等[57]利用焦磷酸测序分析清香型大曲的细菌群落，Tao 等[58]利用焦磷酸测序技术研究了不同窖龄窖泥的原核微生物群落结构，并研究了窖泥中微生物的群落和多样性，Li 等[59]用焦磷酸测序方法对细菌16S rRNA 和真菌内部转录间隔区进行了测序，研究大曲的微生物多样性。

随着测序技术不断的发展，测序数据通量呈指数级增长，生物信息学变得越来越重要，高通量测序数据的处理算法和生物信息学数据库成为宏基因组学发展的重要基础，目前也是宏基因组学发展的一个技术瓶颈[60]。生物信息学是随着各种生物信息学软件的开发而快速发展，这些软件的功能主要有基础分析（Cluster W、BioEdit 等）、亲缘关系分析（Mage、PAUP 等）、指纹图谱分析（Quantity One、T-Ali 等）、群落结构分析（UniFrac、Fast-UnFrac 等）、多样性指数分析（DOTUR 等）、序列提交（Sequin、Sequence Read Archive 等）[61-63]；目前高通量测序发展较快，高通量数据/综合分析软件主要有Mothur、Qiime、RDP、Pipeline 等；基因序列分析的核酸序列数据库主要有GenBank 数据库（美国国家生物技术信息中心），EMBL 数据库（欧洲生物信息学研究所）和DDBJ 数据库（日本国立遗传学研究所）[64]。这些软件和数据库是研究微生物生态的重要基础，在海洋、土壤、人体、食品等领域应用广泛。

蛋白质组学和代谢组学在对微生物生态的研究中也有应用。蛋白质组学的一种新技术——宏蛋白质组学[65]：在特定的时间对微生物群落所有的蛋白质进行分析研究的技术，在极端环境微生物的功能基因表达、特殊功能蛋白质开发以及生态元素循环等方面有一些应用。在白酒微生态研究中应用较少，但已有人利用此技术对窖泥微生态进行研究，例如Zheng 等[66]首先从30 年和300 年的窖泥微生物中提取总蛋白质和DNA，然后利用基于iTRAQ 蛋白组学技术研究微生物表达形成香味的功能蛋白质。

现在代谢组学在生态学领域也开始有越来越多的应用，主要应用在土壤、海洋等传统生态学领域，与蛋白质组学、转录组学和基因组学等技术的结合应用也日益密切。代谢组学[67-68]是通过考察生物体系受到刺激或扰动前后代谢产物图谱及其动态变化来研究生物体系的代谢网络的一种技术，主要研究相对分子质量1000 以下的内源性小分子。近年来代谢组学与生态学相结合出现了一门新兴学科——生态代谢组学[69]，其定义为对某一生物系统中产生的或已存在的代谢物组的研究的建立与发展。

各学科技术的交叉结合使用为生态学研究提供了有力的工具，我们可以利用宏基因组学、宏转录组学、宏蛋白质组学及代谢组学对酿酒微生物生态在不同层面进行研究，包括窖泥、糟醅、大曲的微生物群落结构、多样性、以及微生物繁殖代谢与环境因子的关系、特殊功能性微生物及其产物、筛选分析未知微生物等。白酒酿造中微生物非常复杂，将来利用这些技术进一步揭示白酒微生物酿造规律，进而指导白酒生产，既可以促进生产更多优质白酒，又可以弘扬中国传统文化。