培养条件对草莓花粉萌发的影响

霍辰思，刘 伟，樊新萍，白牡丹，尚勇进

（1.山西农业大学果树研究所，山西太原030031；2.园艺植物脱毒与繁育技术国家地方联合工程研究中心，山西太谷030815）

草莓属蔷薇科多年生雌雄同株草本植物，自花结实率低，生产上一般采用人工授粉或蜜蜂授粉方式提高其坐果率和授粉率[1]。花粉质量的好坏主要是通过花粉活力进行评判，在果树授粉前都会对其父本花粉进行生活力测定[2]。近几年，随着温室大棚蓬勃发展，草莓种植业也快速提升。目前，我国种植的草莓品种基本上都是从美国以及日、韩等国家引进的外来品种，草莓亲本遗传背景狭窄，培育本土优良性状草莓品种显得尤为重要。迄今为止，常规杂交育种仍是我国品种选育的主要途径[3]，掌握草莓不同品种花粉特性，是合理配置授粉植株、提高草莓坐果率的重要依据。

目前，对花粉活力的鉴定方法可归纳为染色剂法、电镜形态观察法、萌芽测定法、田间授粉法等[4]。其中，染色剂法根据染色液类别不同，又可分为I2-KI染色法、TTC染色法、MTT染色法、亚历山大染色法、醋酸洋红染色法和苯胺蓝染色等；萌芽测定法包括离体萌发测定法和活体萌发测定法[5]。染色法虽然操作简单，但由于染色液大部分为有毒试剂，且测定结果差异较大，仅适用于田间授粉快速检测；而与染色法相比，花粉离体萌发试验虽然操作复杂，但用该方法测定所得数据科学可靠，是目前杂交育种中花粉生活力测定的常用方法[6]。

本研究采用花粉离体萌发法测定草莓花粉的生活力（通过设计蔗糖浓度梯度为0、5%、10%、15%；硼酸浓度梯度为0、0.10%、0.15%，琼脂浓度为4 g/L），对4个品种草莓花粉进行培养，旨在筛选出适合草莓花粉萌发的最优培养基，并进一步探讨不同培养温度和培养时间对花粉活力的影响，为今后草莓杂交授粉及新品种选育提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料及处理

选取香野、章姬、圣诞红和红颜4个草莓品种花粉为供试材料，其采自山西农业大学果树研究所草莓大棚。于2020年4月23日至6月4日10：00左右采集大、中花蕾于纸袋中，晾置于温度25℃阴凉通风室内；后用镊子将健康花药剥入硫酸纸折成的小盒，放入干燥器中；待花药自然开裂散粉后，将其收入小瓶中，置于4℃冰箱中贮藏备用。

1.2 试验方法

1.2.1 草莓花粉数量及畸形花粉率统计 收集草莓中花蕾期花朵，剥取完整健康花药10～20枚，放入干燥的玻璃小瓶中，于干燥器中散粉，待花粉完全散出后，加入1 mL蒸馏水充分振荡；用移液管吸取0.1 mL花粉水，用蒸馏水稀释至10 mL，然后用移液枪吸取4μL花粉水滴于含凹槽载玻片上，在电子显微镜下观察花粉萌发情况，统计花粉粒总数及畸形花粉粒数，重复3次。采用花粉管离体萌发法测定花粉萌发率。

1.2.2 草莓花粉萌发最适培养基的筛选 通过设计蔗糖和硼酸不同浓度配比，配置硼酸浓度为0、0.10%、0.15%；蔗糖浓度为0、10%、15%；琼脂浓度为4 g/L的固体培养基，每组浓度梯度重复6次。使用前可用微波炉将培养基加热融化后，吸取100μL培养基于凹面载玻片上，待凝固后用解剖针挑取少量花粉均匀散播在培养基上；将载玻片放入铺有湿纱布的培养皿中，将培养皿放到带盖的手术盘中，置于25℃恒温培养箱暗培养5 h以上，在电子显微镜下观察花粉萌发情况，统计花粉萌发率。

1.2.3 草莓花粉萌发最佳时间的筛选 为进一步研究培养时间对花粉萌发的影响，试验设置0、2、4、6、8、10 h时间梯度，用解剖针挑取适量花粉均匀散播在花粉萌发培养基（0.10%硼酸＋15%蔗糖＋4 g/L琼脂）上，置于25℃恒温培养箱暗培养，每次处理重复3次，在电子显微镜下观察花粉萌发状况，统计花粉萌发率。

1.2.4 草莓花粉萌发最佳温度的筛选 试验从低温到高温设置6个温度梯度，分别为5、10、15、25、35、45℃。将花粉均匀撒播在0.10%硼酸＋15%蔗糖＋4 g/L琼脂培养基上，置于恒温培养箱暗培养，每次处理重复3次；培养6～8 h后放到显微镜下观察花粉萌发情况，并统计花粉萌发率。

1.3 数据分析

采用Excel 2003对试验数据进行处理，计算平均值和标准偏差，绘制图表；采用SPSS软件进行单因素方差分析、Duncan多重比较，检验草莓不同品种花粉萌发率的差异（在α＝0.05/0.01水平上进行比较），6次重复。

2 结果与分析

2.1 花粉数量及畸形花粉率分析

从表1可以看出，香野、章姬、圣诞红和红颜每枚花药中的花粉数量分别为20 267、26 467、25 133、10 933粒；正常花粉数分别为17 100、20 200、17 600、7 000粒；4个品种的畸形花粉率除章姬和圣诞红差异不显著，香野和红颜差异极显著，畸形花粉率从高到低依次为红颜＞圣诞红＞章姬＞香野，香野畸形花粉最少，畸形花粉率为15.74%，红颜畸形花粉数最多，畸形花粉率为36.27%。

表1 不同草莓品种畸形花粉率分析

2.2 花粉最适培养基的筛选

从表2可以看出，4个品种花粉萌发率随蔗糖和硼酸浓度的增加呈先升后降的趋势；当培养基的蔗糖浓度为15%和硼酸浓度为0.10%时，花粉萌发率达到最高；其中，香野的花粉在此培养基萌发率最高，为87.55%，显著高于红颜花粉萌发率（72.38%）；圣诞红、章姬花粉萌发率分别为83.05%、83.50%，二者差异不显著；当培养基蔗糖浓度为15%不变、硼酸浓度上升为0.15%时，花粉萌发率有所下降，圣诞红、章姬、香野和红颜萌发率分别为74.87%、68.04%、77.82%和62.66%，其大小表现为香野＞圣诞红＞章姬＞红颜。因此，0.10%硼酸＋15%蔗糖＋ 4 g/L琼脂为草莓花粉萌发的最适培养基。

表2 不同培养基类型的花粉萌发率分析 %

2.3 花粉萌发最佳时间的筛选

从表3可以看出，不同培养时间对草莓萌发率有一定的影响，在4～8 h时，随时间上升4个草莓品种萌发率逐渐升高，在8 h萌发率达到最高；香野萌发率最高，在8 h花粉萌发率为88.54%；红颜花粉萌发率最低，8 h花粉萌发率仅为52.14%，极显著低于其他3个品种。当培养时间超过8 h时，4个品种的花粉萌发率均开始下降，而红颜的花粉萌发率继续增加，说明并不一定是培养时间越长花粉萌发率越高。因此，草莓花粉在0.10%硼酸＋15%蔗糖＋4 g/L琼脂的培养基上培养8 h为花粉萌发的最佳时间。

表3 不同培养时间的花粉萌发率分析 %

2.4 花粉萌发最佳温度的筛选

由表4可知，不同培养温度对草莓萌发率有很大的影响，随培养温度升高4个草莓品种花粉萌发率呈先升高后下降的抛物线趋势，在25℃培养8 h萌发率最高；其中，香野花粉萌发率最高，为87.50%，高于其他培养温度；圣诞红和章姬花粉萌发率分别为81.24%和82.49%，二者差异不显著；红颜萌发率最低，为66.53%。当温度升高到45℃时，香野仍有少量花粉萌发，但萌发率仅为1.01%，其余3个品种几乎未萌发，红颜萌发率为0。因此，低温和高温均不利于草莓花粉萌发，25℃为4个品种花粉萌发的最适温度。

表4 不同培养温度的花粉萌发率分析 %

3 结论与讨论

大量研究表明，花粉活力大小很大程度上受到花粉萌发率高低的制约，花粉萌发率越高，花粉活力越好，授粉后果实的坐果率、果实品质及杂交授粉成功率越高。草莓畸形果及杂交率低很大程度是由于花粉活力太差。不同植物花粉萌发所需培养条件各不相同，不仅受自身发育状况的影响，也受培养基成分、温度、培养时间等的影响[7]，当培养基蔗糖和硼酸浓度适宜时，花粉萌发率达到最高且利于花粉管伸长。蔗糖是花粉萌发和花粉管生长的营养来源，同时又为花粉代谢和跨膜运输提供能量[8]。但过高的蔗糖浓度又会导致花粉萌发率降低甚至不萌发。曾祥久[9]对银杏花粉培养基优化时发现，蔗糖质量浓度为50～100 g/L时，花粉萌发率最高；当质量浓度达到150～200 g/L时萌发率不升反降；宋艳荣[10]对苹果花粉离体培养时发现，蔗糖浓度控制在5%～15%范围内，有利于4种苹果花粉的萌发；当蔗糖浓度大于10%时，则不利于其花粉萌发。本试验结果发现，蔗糖浓度维持在10%～15%时最适草莓花粉萌发；当浓度超过15%时，萌发率降低。此外，花粉离体培养基离不开硼酸的作用，硼不仅是植物生长所需元素，也是花粉萌发不可或缺的元素，培养基如果缺少硼会导致花粉萌发过缓、花粉管生长缓慢甚至抑制其生长[11]。在花粉萌发过程中，硼酸能促进花粉对能源物质的吸收和利用，所以适宜浓度的硼酸也有利于花粉的萌发[12]。在本试验中，硼酸浓度为0.10%时，4个草莓花粉萌发率达到最大值，其他浓度下其萌发率差异不显著；当硼酸浓度超过0.15%时，花粉萌发率降低。也有研究表明，一定浓度的CaCl2对花粉萌发具有促进作用[13]。张瑞等[14]在对薄壳山核桃花粉研究时发现，Ca2+是花粉管极性生长不可缺少的物质，而花粉管尖端是Ca2+集中分布区域，外源给予一定浓度的钙源能促进花粉管伸长。在今后的试验中也可尝试在培养基中加入适量的CaCl2，以达到花粉萌发的最佳效果。

此外，花粉活力也会受到温度的影响，温度与花粉活力呈负相关[15]。杜纪红等[16]研究发现，一般花粉贮藏温度越低寿命越长，当外界温度升高时花粉内部呼吸强度变大，使其代谢旺盛、水分流失、营养物质耗损、酶活性减弱、产生有害次生代谢产物，这些都会加快花粉的衰老与死亡。庞夫花等[17]对草莓新品种宁玉的花粉特性研究发现，宁玉花粉在温度达到45℃时仍有萌发，而红颜在45℃时已不萌发。本研究中，只有香野草莓在45℃下有少量花粉萌发，萌发率仅为1.01%，其他3个品种几乎未萌发；当温度处于25℃时，4个品种草莓均达到最高萌发率，与王壮伟等[18]对丰香草莓花粉的研究结果一致。

不同品种花粉萌发时间也略有不同，草莓相对于桃、杏、李等蔷薇科果树花粉萌发慢，薛晓敏等[19]对李花粉萌发时间筛选发现，李花粉萌发快，2 h下花粉萌发即可满足授粉需求；王壮伟等[18]研究发现，草莓花粉萌发高峰为3 h，3～5 h花粉萌发率趋于稳定；庞夫花等[17]将宁玉花粉培养8 h后花粉萌发率达到最高，随着培养时间延长花粉萌发率逐渐下降。本试验中，4个品种花粉萌发率随着培养时间的延长呈先升后降的抛物线曲线，最强萌发时间为8 h。

本研究采用准确率较高的离体萌发法测定草莓花粉生活力，结果表明，4个草莓品种花粉萌发率最适的培养基为0.10%硼酸＋15%蔗糖＋4 g/L琼脂，当培养基中蔗糖浓度为15%、硼酸浓度为0.10%～0.15%时花粉萌发率差异不显著；花粉萌发最佳温度为25℃，花粉萌发时间为8 h最适宜观察统计。香野具有较强的花粉活力，花粉数量多、畸形花粉率低，这与实际生产上香野草莓果实个大、果实光泽强、果品质量高、畸形果率低等生理现象相符。香野草莓是一个比较容易栽培、经济效益高的优良品种，在育种上可以考虑将其作为父本材料进行授粉，以提高杂交后代的品质和抗性。红颜较其他3个品种花粉萌发率低，畸形花粉数也较多，这与庞夫花等[16]测定红颜花粉萌发率的研究结果相似。尽管生产上红颜草莓已成为国内草莓种植业栽培面积最大的品种，但是由于其抗病性较差，以其作为亲本筛选抗病后代的概率较低。