烟草多酚氧化酶的分离与纯化

李沛文 吴成余

吉林烟草工业有限责任公司 吉林长春 130000

多酚氧化酶（PPOs）是植物中广泛存在的一类铜蛋白物质。在烟草中，多酚氧化酶不但在烟草的整个成长过程中担当着重要的角色，而且影响着烟叶的颜色和香吃味，所以对烟草的多酚氧化酶的研究也有重要的应用前景。本文尝试从新鲜烟叶中提取多酚氧化酶，并进行分离和纯化[1]。

1 仪器与药品

1.1 仪器

多功能食物搅拌机；超声波仪；SHZ-D 循环水式真空泵；海尔冰箱；LC213 型干燥箱；Z 型系列层析柱；BS-100A 型自动部分收集器；HL-2 恒流泵；2000ml 梯度混合器；HD-21-88 核酸蛋白检测仪；721 分光光度计；透析袋； 800 型离心机；PHS-2C型精密酸度计；XS-204 电子天平；磁力搅拌器；可调式电炉等。

1.2 药品及材料

新鲜烟叶； Tris；聚乙烯吡咯烷酮；乙二胺四乙酸二钠；抗坏血酸；半胱氨酸；磷酸二氢钠；氯化钠；硫酸铵；石英砂；十二烷基磺酸钠；N,N,N,N- 四甲基乙二胺；甲叉丙烯酰胺；丙烯酰胺；过硫酸铵；无水甲醇；冰乙酸等。

2 实验步骤

2.1 前处理

2.1.1 采集烟叶

从烟田采集一定量的新鲜成熟烟叶，用洗洁剂将其表面的灰尘和污渍清洗干净，将烟叶切成小的碎片。

2.1.2 粉碎烟叶

把所收集的新鲜烟叶1000g 左右，加入冷丙酮溶液1500mL，浸泡过夜，再用风扇将其吹干，然后再用食物粉碎机粉碎。

2.1.3 均浆烟沫

在粉碎的烟沫中加入pH=7.5 0.05mol/L 的磷酸盐缓冲液1800mL，再加入12g 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。再加入Vc4g，EDTA3g，Cys0.6g。

2.1.4 超声处理

将均浆物在冰水浴中用超声波处理一小时进行细胞破碎。

2.2 粗分级

（1）将处理的物质用六层纱布过滤，收集滤液，加入固体硫酸铵至30% 的饱和度，边加边搅拌使之全部溶解，在4℃的条件下静置4 小时，然后离心取上清液，再往上清液中加入80% 摩尔浓度的硫酸铵。4℃条件下静置，然后再离心，收集沉淀。

（2） 得 到 的 沉 淀 用10mL 0.05mol/L 的Tris-HCl 缓 冲 液（pH=7.5）溶解并在此缓冲液中透析平衡20 小时，这其中每5 小时换一次透析溶液。

（3）将沉淀透析脱盐后，用风扇吹，使之浓缩，准备上Sephadex A50 柱（3.5×70cm）。

2.3 细分级

2. 3.1 柱色谱的准备实验

称取50g Sephadex A-50 置于烧杯中，加入适量的0.05mol/L Tris-HCl 缓冲液浸泡经48 小时，除去上层浑浊液中小颗粒。然后将胶液放在真空干燥器中，脱气20-30 分钟，然后装柱，加满缓冲液，盖上柱塞连接好管路[2]。

2.3.2 柱色谱分离

整个过程为首先用DEAE-Sephadex A-50 柱进行层析分离，两部分活性成分分别收集，并用透析袋脱盐浓缩到10mL，用0.05mol/L 的磷酸缓冲液（pH=7.5）平衡。得到PPO Ⅰ和PPO Ⅱ两部分，然后分别再经过Sephadex G-75 柱（1.5×100cm）分离，收集活性部分并用透析袋脱盐浓缩到10mL 后用0.05mol/L 的磷酸缓冲液（pH=7.5）平衡，然后再分别过DEAE-Sephadex A-50柱（3×60cm）。

2. 3.3 酶活力和蛋白质含量的测定

多酚氧化酶的活性测定和蛋白质含量测定采用分光光度法，以邻苯二酚为底物，在0.05mol/L 的磷酸缓冲液（pH=7.5）中，420nm 的波长下测定酶活力，280nm 的波长下测定蛋白质含量。酶活力单位以如下方法定义，即420nm 的波长下每毫克蛋白质每分钟引起0.01 单位的摩尔吸光度的增加为一个酶活力单位。

表1 分离过程中每一步的相对活力

1- 粗提液；2- 加入30% 硫酸铵后溶液的相对活力；3- 加入80% 硫酸铵后沉淀的相对活力；4- 加入80% 硫酸铵后清液的相对活力；5-DEAE-Sephadex A-50 柱后PPO Ⅰ的相对活力；6-DEAE-Sephadex A-50 柱后PPO Ⅱ的相对活力。

3 结果与讨论

多酚氧化酶的分离分为沉淀法的前处理和层析柱分离的后处理两个步骤。前处理中由于多酚及它们的氧化产物的存在抑制了多酚氧化酶的活性，加入一定量的PVP 能降低醌类物质的多聚体，从而在一定的程度上能降低多酚对蛋白分离的负面影响。

后处理经层析柱分离，从60-130 管发现PPO 活性部分，被定义为PPO Ⅰ。PPO Ⅱ比我们前面所发现的PPO Ⅰ在DEAESephadex A-50 层析柱较后的管数出现，它的相对活力比PPO Ⅰ要大。在280nm 的波谱图上我们可以看到，一共有四个峰，为了确定其活性峰，我们作出了420nm 处的波谱图，从420nm 波谱图与280nmm 波谱图可以得出（图1），峰I 和峰IV 为活性峰，但它们的吻合程度并不好，说明PPO 中还含有杂蛋白，因此还必须继续纯化PPO[3]。

图1 粗蛋白过 DEAE-Sephadex A-50 柱时的总洗脱曲线，其中A 为280nm 时的洗脱曲线，B 为420nm 时的洗脱曲线。色谱柱用0-0.5mol/L 的NaCl 以线性梯度浓度在0.02mol/L Tris-HCl缓冲液中洗脱，pH=7.5，流量18ml/h，4℃。

将过A-50 层析柱后活性较高的PPOI 和PPOII 收集起来装进透析袋进行浓缩，脱盐再分别过Sephadex G-75，然后脱盐后再分别过A-50 柱层析，结果在420nm 作出的波谱图与在280nm 作出的波谱图吻合得比较好（图3.2 和图3.3），说明PPOI 和PPOII提纯得比较好，其中没有杂蛋白了[4]。

图2 过DEAE-Sephadex A-50 以 及Sephadex G-75 后又一次过DEAE- Sephadex -A50 后PPOI 在280nm（图A）和420nm（图B）的总洗脱曲线色谱柱用0-0.5mol/L 的NaCl 以线性梯度浓度在0.02mol/L Tris-HCl 缓冲液中洗脱，pH=7.5，流量18ml/h，4℃。

图3 过DEAE-Sephadex A-50 以 及Sephadex G-75 后 又一 次 过DEAE- Sephadex -A50 后PPOII 在280nm（ 图A） 和420nm（图B）的总洗脱曲线色谱柱用0-0.5mol/L 的NaCl 以线性梯度浓度在0.02mol/L Tris-HCl 缓冲液中洗脱，pH=7.5，流量18ml/h，4℃[5]。

但本文对PPO 只是作了初步试探性的研究，还有不少工作有待进一步开展，如怎样进一步选择适宜的分离手段和条件对多酚氧化酶同工酶进行分离和纯化，以及如何利用更新的方法对多酚氧化酶性质进行研究等，都有待更深入的研究。