Tn1548相关区域在不同种属临床分离菌中多态性及armA跨种属转移可能的机制

·论著·

Tn相关区域在不同种属临床分离菌中多态性及跨种属转移可能的机制

聂璐，吴奎海，陈平熹，杨汉才，李炜煊

528000 广东，佛山市第一人民医院检验科（聂璐、吴奎海、李炜煊）；527200 广东，罗定市人民医院检验科（陈平熹、杨汉才）

复合转座子 Tn一直被认为介导了基因的转移，本研究通过分析基因在不同种属的基因环境，提出基因转移的可能机制。

以 GenBank 库不同种属细菌中已经发现的含有 Tn及 Tn-like 转座子为研究对象，通过生物信息学技术比较分析基因环境的差异，结合基因环境中各种插入元件的工作机制，推测基因跨种属转移的可能机制。

一共有 11 条含有 Tn或者 Tn-like 的全质粒序列纳入分析。这些质粒序列来自不同种属，包括鲍曼不动杆菌、肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌。除鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的质粒类型的不相容组别未知外，其他种属来源的质粒不相容组别涉及 IncU、IncFII(Yp)、IncN、IncL/M、IncL/M、IncA/C2和 IncR 嵌合型，IncA/C、IncFIIK和 IncT。上述结果强烈的提示基因的跨种属转移不是质粒的广泛播散而更可能是转座子或者更小的可移动元件参与其中的事件。进一步对 Tn、Tn-like 转座子及 Tn相关区域的分析发现了基因在转移中侧翼的相对保守区是 IS--IS结构。

结合 IS和 IS元件的工作机制，推测 IS--IS结构极有可能介导了基因在不同种属的广泛播散。

Tn；基因； 氨基糖苷类； 碳青霉烯类； 耐药机制； 跨种属转移机制

细菌耐药性的产生和广泛播散是当前人类健康面临的最重大的挑战之一，是全球公共卫生领域中迫切需要采取行动的重要问题。随着临床医疗和畜牧养殖领域大量无节制地使用甚至滥用广谱抗生素，细菌在抗生素压力选择下也不断地进化产生新的、功能更为强大的耐药酶以适应环境需要。16S rRNA 甲基化酶 ArmA 由基因编码，它能甲基化 16S rRNA A 位点内部的特定位点，使氨基糖苷类抗生素失去与其靶点（核糖体 30S 亚基）结合的能力，从而丧失后续抑制细菌蛋白质合成的效力。该酶不水解药物，而是保护细菌自身免受药物的攻击。ArmA 介导细菌对所有临床一线使用的氨基糖苷类抗生素包括阿米卡星、妥布霉素和庆大霉素等耐药且均为高水平耐药（最小抑菌浓度 MIC > 1024 μg/ml）[1]。

2003 年，基因首次在肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌中检出[2-3]。迄今基因已呈现在全球范围内和不同种属细菌间广泛播散的态势。基因宿主菌几乎涉及到所有有重要临床意义的肠杆菌科细菌各个种属，包括肠杆菌属（阴沟肠杆菌、产气肠杆菌），威登氏菌属（普罗威登氏菌、雷氏威登氏菌），克雷伯菌属（产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌），沙雷氏菌属，弗氏志贺菌以及非发酵菌属如不动杆菌属和假单胞菌属等[4-5]。2007 年报道中国六省市分离的亚胺培南耐药的鲍曼不动杆菌中基因阳性率高达 64.6%[6]。2009 年报道中国温州分离的肺炎克雷伯菌中基因的阳性率为 2%[7]。2014 年日本报道了抽样调查全国 7 省市范围内流行的阳性鲍曼不动杆菌为 ST208 和 ST455 型且呈克隆传播[8]；2017 年报道了基因从铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的检出[9-10]。从 NCBI GenBank 中提交的数据分析，携带基因的菌株分离地域涉及中国、美国、日本、韩国、法国、波兰、西班牙、阿富汗等地。

耐药基因的广泛播散更大程度地取决于耐药基因的侧翼序列，即所处的基因环境，而不是耐药基因自身。基因作为继CTX-M-15和NDM-1之后又一种成功的跨越细菌种属限制、地域限制，常与多种重要耐药基因相关联并且广泛播散的耐药基因，其基因环境值得进一步深入研究。自 2003 年首次阐述基因以来，一直认为世界范围内的广泛播散与 Tn有关[2, 11]。本研究选取 GenBank 中代表性种属中的含有 Tn相关区域的完整质粒序列进行分析，以期为基因跨种属转移机制的研究提供有效线索。

1 材料与方法

1.1 材料

Tn复合转座子长度为 16.6 kb（GenBank accession 号：AF550415），用该序列比对检索 NCBI GenBank 库（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），符合下列特征的质粒序列纳入本研究：①Tn相关区域在全测序的质粒上；②Tn相关区域出现在新的种属。检索 GenBank 库时间为2019 年 6 月。

1.2 方法

从 GenBank 下载纳入研究序列的所有 Fasta 文件，导入 CLC Genomics workbench 软件（版本号 8.5），逐条分析和注释 Tn相关区域序列两个 IS之间的基因，序列中含有的整合子序列提交 INTEGRALL 数据库核定基因盒准确命名（http://integrall.bio.ua.pt/?）。Inkscape 软件（版本号 6.0）绘制基因座位排列图，以及用阴影描绘序列与序列之间两两比较能匹配（核苷酸相似度> 95%）的区域。下载所有质粒序列，提交 PlasmidFinder 在线网站（https://cge.cbs.dtu.dk/ services/PlasmidFinder/）确定质粒类型。

2 结果

2.1 标准 Tn1548 的结构特点

Tn的线性结构（图 1）描述为 IS-In27- IS-IS--IS----IS其结构特点呈现为一个基于 IS的复合型转座子（Composite Transposon；cTn），其中有五个 IS 序列，两个拷贝 IS、IS、IS和 IS。

2.2 Tn1548-like 转座子的结构特征

根据 NCBI GeneBank 中提供的携带基因的质粒测序结果，我们发现 Tn出现了诸多变异形式，如 Tn-like 复合型转座子和 Tn相关区域（如果两个 IS有一个缺失，即不能称为转座子），且其定位的质粒大小差异较大（50 ~ 250 kb)，质粒的不相容组别多样，本文 11 条纳入分析的质粒中，除质粒 pCTX-M3 携带的是 Tn参考序列外，其余 10 条均是 Tn-like 转座子或者 Tn相关区域。这11 条质粒的质粒类型为pKOX_R1（IncU）、pEA49-KPC[IncFII(Yp)]、pMU050（IncN）、pCTX-M3（IncL/M）、pSM_0127（IncL/M）、pNDM1_SZ1（IncA/C2 和 IncR 嵌合）、pSY153-MDR（未知类型）、pMR0211（IncA/C）、pMDR-ZJ06（未知类型）、pKP048（IncFIIK）和pNDM15-1091（IncT），具体如图 1 所示。

3 讨论

3.1 标准 Tn1548 与armA 基因迁徙过程间的关联

首次阐述基因（2003 年），是在一株临床分离肺炎克雷伯菌BM4536 携带的IncL/M 型质粒 pIP1204 中，质粒大小约 90 kb，该质粒同时编码超广谱 β-内酰胺酶CTX-M-3[2]。基因广泛转移有两个基因学基础：一是质粒，基因被发现位于不同种属细菌的不同质粒不相容类别的质粒上，质粒尤其是广宿主质粒，在不同宿主间穿梭介导基因广泛转移；二是 Tn，定位于 Tn中插入序列共同区（insertion sequence common region，IS1）下游，两侧有两个 IS，这些元件与耐药基因的广泛播散密切相关。

Tn的结构特点呈现为一个基于 IS的复合型转座子，一直被认为是介导基因转移的核心转移元件。其转移的机制理论上是两个同方向的 IS元件，带着中间的序列以“剪切、粘贴”的方式进行复制型转座实现耐药基因分子间的转移。插入序列 IS的转座酶（）是执行该转座过程主要的酶。进一步的试验表明 Tn能够从构建的质粒中成功转移至受体菌的质粒中，从而证实了它作为一个整合子是有功能的，可以实现 Tn整体的转移[11]。

图 1 Tn1548、Tn1548-like 转座子和 Tn1548 相关区域线性结构比较图。阴影部分表示序列两两之间比较核苷酸相似性大于 95%

Figure 1 Linear comparison of Tn, Tn-like transposon and Tnrelated regions. Shading denotes regions of homology that more than 95% nucleotide identity

Tn有五个 IS 序列，为两个拷贝 IS、IS、IS和 IS紧邻基因上游和下游分别有一个 IS和 IS，它们分别属于 IS和 IS家族成员，其中 IS被发现与雷氏普罗威登氏菌中的一个转座酶同源性高达76%，推测这两个 IS 序列首先移动到基因来源菌（目前尚不清楚）的染色体中基因的上下游，介导和启动了基因在其来源菌的移动[12]。

3.2 Tn1548-like 转座子结构共性

随着基因在各种属的播散，NCBI GeneBank 中提供的携带基因的质粒测序结果不断丰富，我们发现 Tn出现了诸多变异形式，根据本研究中 11 条质粒，这些结果强烈提示基因的播散不是简单地广宿主质粒在不同种属中的直接穿梭，而是更可能涉及转座子进一步参与其中的事件。

比较不同种属中 Tn、Tn-like 转座子和 Tn相关区域的结构共性，我们得出结论，Tn8 内部有一个高度可变区及相对保守区，高度可变区位于 IS元件上游，我们可以看到 IS上游 IS可以缺失，整合子中的 I 型整合酶可以缺失，整合子内部的基因盒可以动态地捕获或者缺失，I 型整合子的 qacE/sul1 也可以缺失。与此相反的是，IS元件下游至 IS区域相对保守，IS-IS--IS--- --IS的结构除了有一株菌中最后一个 IS缺失外（可能由于同源重组丢失），其他菌株中均有这个结构，只是有些菌株在此结构基础上获得了额外的插入序列，比如在 pMDR-ZJ06中 orf543 内部插入了 IS，pKOX_R1 和 pNDM15-1091 中 orf543 上游插入了 IS，假单胞菌中质粒 pSY153-MDR 中IS下游和上游分别插入了 IS和 IS。

3.3 armA 基因核心转移元件的推测

有学者曾指出，Tn以及各种 Tn相关元件（插入各种不同的 I 型整合子或者 IS和 IS之间的整合子样序列）被认为是促进了氨基糖苷类耐药基因，大环内酯类耐药基因簇(E)-(E)及其他整合子内耐药基因的转移[13]。但是根据本研究汇总的 Tn、Tn-like 以及 Tn相关区域在不同种属的差异和共性，以及 IS元件和 IS元件的特性，我们推测，基因的转移更有可能是 IS和 IS两个元件共同介导。具体的讲，是 IS和 IS元件能形成一个 IS--IS环形结构，这个结构在细菌细胞中的维持依赖于，编码鲍曼不动杆菌中的复制起始蛋白，能执行质粒复制起始功能。

综上所述，基于 Tn，Tn-like 转座子、Tn相关区域在不同种属的结构的差异与共性以及 ISCR1 和 IS26 两个广泛参与耐药基因转移的元件的工作机制，我们推测 IS--IS元件极有可能介导了基因的跨种属转移，Tn及 Tn-like 转座子作为公认的基因转移的元件，我们不予否认，但是 IS--IS元件可能转移的效率更高，需要进一步设计实验以证实该推测。

[1] Doi Y, Arakawa Y. 16S ribosomal RNA methylation: emerging resistance mechanism against aminoglycosides. Clin Infect Dis, 2007, 45(1):88-94.

[2] Galimand M, Courvalin P, Lambert T. Plasmid-mediated high-level resistance to aminoglycosides in Enterobacteriaceae due to 16S rRNA methylation. Antimicrob Agents Chemother, 2003, 47(8):2565-2571.

[3] Yokoyama K, Doi Y, Yamane K, et al. Acquisition of 16S rRNA methylase gene in Pseudomonas aeruginosa. Lancet, 2003, 362(9399): 1888-1893.

[4] Yamane K, Wachino JI, Doi Y, et al. Global spread of multiple aminoglycoside resistance genes. Emerg Infect Dis, 2005, 11(6):951- 953.

[5] Yamane K, Wachino J, Suzuki S, et al. 16S rRNA methylase-producing,gram-negative pathogens, Japan. Emerg Infect Dis, 2007, 13(4):642-646.

[6] Yu YS, Zhou H, Yang Q, et al. Widespread occurrence of aminoglycoside resistance due to ArmA methylase in imipenem- resistant Acinetobacter baumannii isolates in China. J Antimicrob, 2007, 60(2):454-455.

[7] Yu F, Wang L, Pan J, et al. Prevalence of 16S rRNA methylase genes in Klebsiella pneumoniae isolates from a Chinese teaching hospital: coexistence of rmtB and armA genes in the same isolate. Diagn Microbiol Infect Dis, 2009, 64(1):57-63.

[8] Tada T, Miyoshi-Akiyama T, Shimada K, et al. Dissemination of 16S rRNA methylase ArmA-producing acinetobacter baumannii and emergence of OXA-72 carbapenemase coproducers in Japan. Antimicrob Agents Chemother, 2014, 58(5):2916-2920.

[9] Liu J, Yang L, Chen D, et al. Complete sequence of pBM413, a novel multidrug resistance megaplasmid carrying qnrVC6 and bla IMP-45 from pseudomonas aeruginosa. Int J Antimicrob Agents, 2018, 51(1): 145-150.

[10] Yuan M, Chen H, Zhu X, et al. pSY153-MDR, a p12969-DIM-related mega plasmid carrying blaIMP-45 and armA, from clinical Pseudomonas putida. Oncotarget, 2017, 8(40):68439-68447.

[11] Galimand M, Sabtcheva S, Courvalin P, et al. Worldwide disseminated armA aminoglycoside resistance methylase gene is borne by composite transposon Tn1548. Antimicrob Agents Chemother, 2005, 49(7):2949-2953.

[12] Toleman MA, Bennett PM, Walsh TR. ISCR elements: novel gene-capturing systems of the 21st century? Microbiol Mol Biol Rev, 2006, 70(2):296-316.

[13] Sun F, Zhou D, Sun Q, et al. Genetic characterization of two fully sequenced multi-drug resistant plasmids pP10164-2 and pP10164-3 from Leclercia adecarboxylata. Sci Rep, 2016, 6: 33982.

Polymorphism of Tnassociated regions in different species and possible mechanism ofinterspecies transfer

NIE Lu, WU Kui-hai, CHEN Ping-xi, YANG Han-cai, LI Wei-xuan

000

Composite transposon Tnis thought to mediate the wide spread ofgene. This study aims to analyze the genetic background ofin different species, and propose the possible mechanism of interspecies transfer ofgene.

Using Tnand Tn-like transposons found in different species of bacteria in GenBank as the research object, the difference ofgene environment was compared and analyzed through bioinformatics method, and the possible mechanism ofgene transfer across species was speculated based on the working mechanism of various insertion elements ingene environment.

A total of 11 plasmid sequences contained Tnassociated regions were enrolled in our study. These plasmids were all carried by different species, including.,,. In these species,gene were carried by a wide range of different incompatibility group plasmids, such as IncU, IncFII(Yp), IncN, IncL/M, IncL/M, IncA/C2 and IncR mosaic plasmid, IncA/C, IncFIIKand IncT. These observations strongly suggested transfer ofis not mediated by plasmids, whereas by transposons or smaller transferable element. We analyzed the structures shared the 11 Tnassociated regions, and found that IS--ISregion in Tnwere highly conserved.

Based on the mechanism of ISand IS,we proposed thatIS--ISelementmay mediate thegene transfer across species.

;; Aminoglycosides; Carbapenemes; Resistance mechanisms; Mechanism of interspecies transfer

LI Wei-xuan, Email: lwx21cn@163.com

佛山市卫生健康局医学科研课题（20200159）

李炜煊，Email：lwx21cn@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.06.006

Author Affiliations: Department of Laboratory Medicine, The First People′s Hospital of Foshan, Guangdong 528000, China (NIE Lu, WU Kui-hai, LI Wei-xuan); Department of Laboratory Medicine, The People′s Hospital of Luoding, Guangdong 527200, China (CHEN Ping-xi, YANG Han-cai)

2020-06-02