非小细胞肺癌细胞株HCC827克隆异质性及其与吉非替尼敏感性的关系

罗凯，黎谢梦丹，董静，王倩

广州医科大学附属肿瘤医院/广州医科大学肿瘤研究所，广东广州510095

肺癌是严重威胁人类健康的主要恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌的83%[1]。表皮生长因子受体(EGFR)突变型NSCLC是肺癌的一种重要分子亚型。研究[2]表明，EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)治疗EGFR突变型NSCLC可获得良好的疗效，然而其原发和继发耐药不可避免，且机制仍未完全阐明，其中吉非替尼是最经典的一代EGFR-TKI类药物，现在临床应用广泛[3]。异质性是恶性肿瘤的一个重要特征，其整体表现为同一肿瘤内部或不同病灶间肿瘤细胞的差异性[4]。多项研究[5]表明，肿瘤的异质性与药物治疗的反应性密切相关，然而EGFR突变型NSCLC的异质性特征及其动态演化规律与EGFR-TKI治疗反应性的关系尚未完全阐明，且缺少相关实验依据，值得进一步研究。2018年3月5日～2019年12月20日，本研究观察了NSCLC细胞株HCC827的克隆异质性，并分析其与吉非替尼药物敏感性的关系，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂 HCC827细胞株购自中科院上海细胞所；胎牛血清与1640培养基购自Gibco公司；吉非替尼购自selleck公司；lipo2000购自Thermo公司；EGFR基因突变检测试剂盒购自北京鑫诺美迪公司；MET、HER2基因扩增检测试剂盒购自厦门艾德公司；MTS、细胞基因组DNA提取试剂盒购自Promega公司；pEGFP-N1与pDsRed1-N1质粒为本实验室保存。流式细胞仪购自BD公司；一代基因测序仪购自Thermo公司；荧光显微镜购自徕卡公司；多功能酶标仪购自BioTek公司。

1.2 单克隆化子代细胞的获取及分组 取对数生长期HCC827细胞，胰酶消化并过滤后获得单细胞悬液，利用极限稀释法将极低浓度细胞悬液接种至96孔培养板，显微镜下确认各培养孔的细胞数量，筛选仅存在单个细胞的培养孔，持续培养3周后将96孔培养板中的单克隆化HCC827细胞转移至6孔培养板中扩大培养，并最终获得单克隆化HCC827子代细胞株12株，随机选择其中6株单克隆化子代HCC827细胞进行后续实验，分为A、B、C、D、E、F组。另取对数生长期HCC827细胞，记为亲代细胞组。各组胞均利用含10%胎牛血清的1640培养基在5% CO2和37 ℃条件下培养，待细胞融合度70%～80%时进行相关实验。

1.3 各组细胞增殖能力异质性观察 ①各组细胞平板克隆形成数观察。采用平板克隆形成实验。取各组细胞，按每孔500个细胞的数量将细胞接种至6孔培养板上，每个细胞设置3个平行培养孔，3 d换培养液一次，连续培养10 d后弃去培养液，70%预冷乙醇固定后，结晶紫染色，纯水洗涤后晾干培养板，计数各组细胞平板克隆形成数。②各组细胞增殖倍数观察。采用细胞生长曲线实验。取200 μL浓度5×103个/毫升的对数生长期各组细胞接种至6块96孔细胞培养板中，每组细胞在每块培养板中设置5个重复培养孔，待细胞贴壁后分别在0、24、48、72、96、120 h时取一块培养板，在培养板的各个细胞培养孔中分别加入20 μL MTS，继续培养3 h后测定各培养孔的吸光度值，以0 h的吸光度值为基数，计算各组培养24、48、72、96、120 h时的细胞增殖倍数。

1.4 各组细胞对吉非替尼敏感异质性观察 采用细胞药敏实验。取各组细胞，按每孔2 000个接种至96孔培养板中，每组细胞设置无药物空白对照孔和8个浓度梯度药物孔，待细胞贴壁后，8个浓度梯度药物孔分别加入2.00×104、1.00×104、5.00×103、2.50×103、1.25×103、625、312.50、156.25 μmol/L的吉非替尼，继续培养48 h，每孔加入20 μL MTS，继续培养3 h后测吸光度值，利用emuch IC50软件计算各组细胞的IC50值，以IC50值表示各组细胞对吉非替尼敏感性，并筛选对吉非替尼最敏感和最耐药的细胞组。

1.5 各组细胞遗传异质性观察 ①各组细胞EGFR基因检测。采用Sanger直接测序法。利用基因组DNA提取试剂盒提取各组细胞DNA后，依据EGFR基因突变检测试剂盒说明书步骤PCR扩增细胞EGFR基因第18～21外显子，利用虾碱性磷酸酶复合物消化PCR扩增产物后行二次测序扩增反应，再利用醋酸钠法对测序扩增产物进行纯化，将纯化后的测序扩增产物上机测序，待获得样品EGFR基因第18～21外显子序列信息后，将之与标准序列进行比对以获得基因突变检测结果。②各组细胞MET、HER2基因检测。采用荧光原位杂交实验。依据MET、HER2基因扩增检测试剂盒说明书步骤，制备细胞滴片后，先用蛋白酶处理细胞滴片，再煮沸变性，随后滴加探针杂交过夜，次日DAPI复染后，荧光显微镜下观察结果。MET基因扩增结果判读标准：计数30个细胞，观察细胞内红色信号点总数、绿色信号点总数，计算Ratio值(Ratio值=细胞内红色信号点总数/细胞内绿色信号点总数)；当Ratio值≥1.8或MET信号连接成簇，判断为阳性结果，其余为阴性结果。HER2基因扩增结果判读标准：计数30个细胞，计算Ratio值和HER2信号数(HER2信号数=红色信号点总数/30)；当Ratio值≥2.0或HER2信号数≥6.0时为阳性，当Ratio值<2.0或HER2信号数<4.0时为阴性，当Ratio值<2.0且HER2信号数在4～6之间时，增加计数20个细胞后重新判读结果。

1.6 吉非替尼对细胞异质性的动态影响观察 采用细胞克隆混合实验。利用lipo 2000将pEGFP-N1空载质粒(绿色荧光)、pDsRed1-N1空载质粒(红色荧光)分别转染对本研究中对吉非替尼最敏感、最耐药的细胞组，取亲代细胞组，将三组细胞分别进行等比例混合培养，记为敏感+耐药克隆组、敏感+亲代细胞组、耐药+亲代细胞组，各组细胞于荧光显微镜下拍摄细胞荧光状态后，加入1.5 μmol/L吉非替尼处理，并设置加入空白溶剂的空白对照组，分别记为敏感+耐药克隆对照组、敏感+亲代细胞对照组、耐药+亲代细胞对照组，连续培养两周，其间换液后细胞继续加药处理，两周后再于荧光显微镜下拍摄细胞荧光状态，比较各组荧光标记细胞的比例变化规律。

2 结果

2.1 各组细胞增殖能力比较 ①各组细胞平板克隆形成数比较。亲代细胞组与A～F组的平板克隆形成数分别为(190.00±2.83)、(171.00±10.21)、(210.00±8.59)、(203.00±5.33)、(158.00±7.46)、(174.00±6.89)和(187.00±12.07)个，其中B组克隆形成数高于亲代细胞组(P<0.01),A、D和E组克隆形成数低于亲代细胞组(P均<0.05)。②各组细胞增殖倍数比较。各组细胞增殖倍数比较见表1。由表1可知，B、F组细胞培养48、72、96、120 h时的增殖倍数与亲代细胞组相比，P均<0.05;C、D组细胞培养72、96、120 h时的增殖倍数与亲代细胞组相比,P均<0.05;提示亲代细胞与各子克隆细胞间存在明显的增殖能力异质性，其中B组细胞增殖倍数最高，D组细胞增殖倍数最低。

表1 不同时间点各组细胞增殖倍数比较

2.2 各组细胞对吉非替尼敏感性比较 亲代细胞组与A～F组细胞对吉非替尼的IC50值分别为(1.00±0.04)、(1.61±0.21)、(1.38±0.29)、(3.77±0.35)、(20.57±0.39)、(6.47±0.52)、(1.91±0.13)μmol/L，其中B组细胞对吉非替尼的IC50值与亲代细胞组相比，P>0.05，表明B组细胞为对吉非替尼最敏感的细胞组；其余各组细胞对吉非替尼的IC50值与亲代细胞组相比，P均<0.05，其中D组细胞IC50值最高，表明D组细胞为对吉非替尼最耐药的细胞组。

2.3 各组细胞遗传异质性比较 EGFR基因突变检测结果显示，亲代细胞组与A～F组细胞均为EGFR基因19 Del突变。荧光原位杂交实验结果显示，D组细胞HER2基因扩增为阳性(Ratio值为2.04)、MET基因扩增为阴性，而亲代细胞组和A、B、C、E、F组细胞HER2基因和MET基因扩增均为阴性，表明亲代细胞组与D组细胞在遗传背景上存在异质性。

2.4 吉非替尼对细胞异质性的动态影响比较 荧光显微镜下观察发现，敏感+耐药克隆对照组细胞混合培养后，敏感细胞比例占优，而敏感+耐药克隆组细胞混合培养后基本仅余耐药细胞，敏感细胞零星可见；敏感+亲代细胞对照组混合培养后，敏感细胞比例基本未变，而敏感+亲代细胞组细胞混合培养后，残留细胞明显减少，且残留细胞中亲代细胞比例高；耐药+亲代细胞对照组混合培养后，耐药细胞比例下降，而耐药+亲代细胞组细胞混合培养后，残留细胞明显增多，且残留细胞中耐药细胞比例高。

3 讨论

以EGFR为靶点的EGFR-TKIs药物治疗正式开启了NSCLC的靶向治疗新历程，截至目前EGFR-TKIs类靶向药物已发展了三代并均获批进入临床应用，而第四代EGFR-TKIs类靶向药物现正在研制当中[3]。EGFR-TKIs靶向治疗在使EGFR突变型NSCLC患者取得临床获益的同时，EGFR-TKIs靶向耐药却也如影相随，大多数患者在接受EGFR-TKIs靶向治疗12个月左右均不可避免出现继发耐药[6]。吉非替尼与厄洛替尼是一代EGFR-TKIs的代表性药物，阿法替尼是二代EGFR-TKIs的代表性药物，当NSCLC患者接受一代或二代EGFR-TKIs治疗后，约60%患者出现EGFR基因的二次T790M突变，而该突变导致EGFR蛋白变构，变构的EGFR蛋白与一代或二代EGFR-TKIs的结合力下降导致继发耐药[7]。三代EGFR-TKIs类药物奥希替尼针对合并T790M突变的NSCLC患者开发，其不仅可用于常规EGFR突变型NSCLC患者的靶向治疗，还可用于出现二次T790M突变的一代或二代靶向治疗耐药NSCLC患者的后续治疗[8]。四代EGFR-TKIs则是针对三代常见C797S耐药突变开发的新一代EGFR-TKIs[9]。研究[7]显示，EGFR-TKIs耐药机制可分为四个大类：EGFR基因二次突变、下游分子异常激活、旁路活化和组织细胞表型转变。同时部分EGFR突变型NSCLC患者在EGFR-TKIs靶向治疗前就表现为原发耐药，已报道原发耐药机制与继发耐药机制类同，如HER2扩增和c-MET扩增就既与原发耐药相关又与继发耐药相关[10-11]。而EGFR-TKIs靶向治疗耐药的复杂性也从侧面体现了NSCLC的高度异质性。

肿瘤的异质性是恶性实体瘤的一种重要特征，在细胞层面可表现为不同肿瘤细胞间的遗传异质性和表型异质性，在整体层面异质性又可表现为空间异质性和时间异质性，也即病灶不同部位或不同病灶间的差异性和不同病程中肿瘤的差异性[4]。近来随着单细胞测序技术的发展和应用，人们认识到肿瘤是由时空动态变化着的各种亚克隆细胞组成的混合物，在不同肿瘤微环境的筛选作用下，不同亚克隆细胞呈现阳性趋同进化趋势[12]。GERLINGER等[13]报道，在4例肾癌患者治疗前后的原发灶和转移灶中，通过多点取样行基因检测发现，不同取样位点的突变基因谱存在明显差异，同时针对不同取样位点进行独立测序可构建肿瘤的进化分支。NICHOLAS等[14]利用代表性寡核苷酸分析技术对手术切除的肿瘤组织不同部位进行了基因拷贝数分析，发现肿瘤组织的不同部位其基因拷贝数存在明显的异质性，并呈现出一定的进化相关性。本研究首先从细胞表型上分析了人NSCLC细胞株HCC827的异质性，发现在增殖表型上不同子克隆细胞具有明显的异质性，同时不同子克隆细胞对吉非替尼的药物反应性也存在明显的异质性，其中D号克隆耐药指数超过亲代细胞20倍。在遗传异质性方面，本研究发现亲代HCC827细胞和各子代细胞均存在EGFR基因的19 Del突变，此外D号克隆还存在额外的HER2基因扩增，提示各子克隆细胞存在共同的克隆起源，但不同细胞克隆间已出现了遗传背景演进，以上研究结果为NSCLC肿瘤异质性的存在提供了直接的实验证据。

肿瘤的异质性还与肿瘤的治疗抵抗相关。SHI等[15]检测了6例存在EGFR基因激活突变并对EGFR-TKI敏感NSCLC患者EGFR-TKIs治疗前以及最终耐药后的肿瘤组织样本，发现部分患者在靶向治疗前的原发病灶中就已经存在了EGFR基因突变型和野生型两种细胞，而在部分靶向治疗耐药后的肿瘤组织样本中已检测不到治疗前检测到的EGFR基因突变。本研究首次发现，在EGFR-TKI敏感的HCC827细胞中存在HER2基因扩增的原发吉非替尼耐药子克隆细胞(D号克隆)并获得了相应细胞株。理论上，当耐药细胞与敏感细胞混合培养时，给予药物作用后应优选出耐药细胞。在本研究中，将增殖能力强且对EGFR-TKI敏感的B号克隆细胞与增殖能力较弱且耐药的D号克隆细胞混合培养后，增殖能力强的B号克隆细胞逐渐转变为优势克隆；对混合培养细胞给予吉非替尼药物压力后，D号克隆细胞却逐渐转变为绝对优势克隆细胞，与理论推测相符。然而表型检测实验结果显示，HCC827细胞中存在多个对吉非替尼不同程度耐药的细胞克隆且其增殖能力各不相同，同时细胞克隆混合实验显示将B号克隆和D号克隆分别与亲代HCC827细胞等量混合培养后，在吉非替尼药物压力下，两组中均有无荧光标记细胞残留，其中D号克隆加HCC827细胞组残留细胞中无荧光标记的HCC827细胞比例与D号克隆接近，提示HCC827细胞中还存在着其他耐药细胞克隆。前期实验[16]结果显示，在利用低浓度吉非替尼长时间诱导HCC827细胞获得继发耐药HCC827/AR细胞后，遗传背景检测未见HCC827/AR细胞存在HER2基因扩增。我们分析认为，其一，HCC827细胞中还存在着其他耐药细胞克隆又或在长期培养过程中演化出了其他的EGFR-TKI耐药子克隆；其二，在吉非替尼药物压力下，D号耐药克隆可取代增殖能力更强的敏感克隆成为相对优势克隆，但在耐药子克隆集合中增殖能力更强的一个或多个子克隆可能成为最终的优势克隆；其三，不同的药物浓度和药物作用时间可能会对肿瘤细胞的异质性造成不同的筛选效应。本研究结果提示NSCLC存在复杂的肿瘤异质性，且与EGFR-TKI耐药相关，同时EGFR-TKI治疗又会促进肿瘤异质性的演进；其次，靶向治疗耐药后检测到的相关耐药突变并不一定能全面反应体内肿瘤的耐药状况，在制定后续治疗方案时应考虑异质性的影响。

最后，本研究虽从细胞层面证实了NSCLC肿瘤异质性的存在，并探讨了异质性与吉非替尼耐药的关系，但尚缺乏体内实验进行进一步验证，值得进一步研究。

综上所述，NSCLC在增殖能力、药物敏感性等表型层面和驱动基因等遗传背景层面均存在明显的克隆异质性，并且其克隆异质性与吉非替尼敏感性相关，在吉非替尼的作用下，肿瘤异质性呈现动态演进的变化。