转RD29A:DREB1A融合基因小麦的获得及其抗旱性研究

柳 娜，杨文雄，王世红，张雪婷，杨长刚

(甘肃省农业科学院小麦研究所，甘肃兰州 730070)

小麦是我国以及世界范围内最主要的粮食作物。干旱是导致小麦产量减少的最主要环境因素[1]。通过品种改良提高小麦抗旱能力，增加干旱环境下的小麦产量对保证国家粮食安全具有重要的意义。传统农作物育种存在效率比较低和周期较长的缺点。随着分子生物学技术以及遗传转化技术的发展，转基因已经越来越多的运用于植物的品种改良。与传统育种相比，转基因技术针对性强、效率高，并且所需周期极大地缩短。理论上转基因技术可以用于转化任何供体基因组，从而能够有效地利用不同物种间的优良基因[2]。植物能够通过生理及分子水平的改变适应干旱环境的变化。不同种类的植物诱导不同类型基因的变化来响应外界胁迫[3]。转录因子调控相关下游干旱相关基因介导植物干旱响应[4]。干旱应答元件结合蛋白质(Dehydration-responsive element-binding protein )是一类包含有AP2的DNA结合域的转录因子[5]。在拟南芥中，DREB1A通过结合到A/GCCGAC的核心序列，调控下游基因的表达，以响应干旱、高盐和冷胁迫[6]。外源拟南芥DREB1A的转基因能够提高水稻、番茄、小麦等作物对环境胁迫的适应能力[1,3,7-9]。目前在小麦遗传转化过程中，通常采用强启动子CaMV35S驱动外源基因在转基因小麦中表达。CaMV35S启动子是一种组成性表达的启动子，因此CaMV35S驱动的基因往往在转基因植物的各个组织中和不同的生理阶段高表达，而这种持续性的高表达往往影响了转基因植物的其他生长发育表型，最终导致了转基因植物的生长发育受到严重影响[3,10-12]。RD29A是一类响应干旱以及逆境特异诱导型启动子，仅仅在干旱或者逆境诱导下特异表达[13]。利用干旱诱导型启动子RD29A取代CaMV35S启动子驱动DREB1A的表达，能够显著降低外源转基因对植物生长的影响[7]。RD29A:DREB1A转基因番茄的生长发育没有受到显著的影响，但抗旱和抗冷性明显提高[3]。以上研究说明，用启动子RD29A替代CaMV35S能够在不严重影响植物生长的情况下发挥DREB1A抗旱的作用。然而有关外源RD29A:DREB1A导入后小麦的抗旱性及产量相关农艺性状变化的研究目前尚不多见。本研究利用转基因技术将RD29A:DREB1A导入到小麦品种陇春30中，对转基因小麦抗旱生理指标进行了考察，同时筛选得到生长表型正常、抗旱性强的转基因植株，以期为小麦抗旱分子育种研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

转基因小麦受体材料为甘肃省审定的优良品种陇春30。拟南芥所用生态型为Col-0。受试材料均于甘肃农业科学院抗旱棚下植于塑料盆中。实验用土取自于大田中的耕层土壤。土壤风干后进行过筛处理。设正常水分处理(土壤相对含水量70%左右)和干旱处理(土壤相对含水量35%～50%)，选择生长一致的盆栽小麦于开花后第3天开始隔日称重控制水分，干旱期间利用土壤养分，不另施肥。

1.2 启动子和基因克隆引物以及转基因鉴定引物

RD29A启动子为利用RD29A-F：TGTTT AAGGTGGAGAAGCTG以及RD29A-R：ATC TTTTTTTTTGCTTTTTGGAACTCATGTCG引物从拟南芥生态型Col-0基因组DNA中扩增得到。DREB1A序列为利用DREB1A-F:AT GAACTCATTTTCTGCTTT和DREB1A-R:ATAACTCCATAACGATACGT从拟南芥拟南芥生态型Col-0中cDNA扩增所得，引物DREB1A-F:ATGAACTCATTTTCTGCTTT，DREB1A-R:ATAACTCCATAACGATACGT。转基因小麦阳性单株PCR鉴定引物为RD29A-F:TGTTTA AGGTGGAGAAGCTG，载引物为R：GGGTT TCTACAGGACGTAAC。将RD29A启动子序列以及DREB1A基因序列通过同源重组克隆到pBI121载体，同时将4×MYC标签通过同源重组整合到DREB1A基因序列末端。

1.3 培养基

小麦转基因所用培养基为脱分化培养基、继代培养基、分化培养基和生根培养基，详细配方参考文献[14]。

1.4 基因转入方法

利用拟南芥生态型Col-o基因组DNA和cDNA分别扩增获得RD29A启动子以及DREB1A基因。将构建完成的RD29A:DREB1A-4MYC-pBI121质粒利用基因枪转化到受体品种陇春30中，并对后代进行分化和筛选。

1.5 Southern印记

利用CTAB法提取3周大小转基因小麦叶片基因组DNA。利用HindⅢ(Takara)过夜消化基因组DNA。消化好的DNA电泳后转移到尼龙膜上(Roche)。将标记好的探针与尼龙膜孵育并完成杂交后洗脱显影[15]。

1.6 荧光定量PCR检测

利用植物总RNA提取试剂盒(Takara)提取总RNA，并利用反转录试剂盒进行反转录(Takara)。荧光定量PCR加测引物qDREB1A-F:TTCGGTTTCCTCAGGCGGTG，qDREB1A-R:TGTTTGGTTCTCTAACCTCA；ACTIN-F:GT TCCAATCTATGAGGGATACACG， ACTIN-R： GAACCTCCACTGAGAACAA[16]。

1.7 转基因小麦生理指标测定

利用三叶期小麦进行干旱处理，干旱处理停止浇水7 d后进行复水。对照和干旱处理材料分别取0.5 g用于生理指标分析。脯氨酸含量测定参考张忠殿等[17]的方法。可溶性糖含量参考Hakimi 等[18]的方法提取和测定。H2O2含量参考Luna等[19]的方法进行测定。MDA含量参考Sairam等[20]的方法进行提取和测定。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性按照Zhang等[21]的方法提取和测定。所有指标测定均进行三次生物学重复。

1.8 转基因小麦种植及其产量性状测定

用T3代纯合家系考察转基因小麦产量。对照和转基因每个家系分别挑选9株生长一致的幼苗种植人工气候室的花盆中。人工气候室光照强度为500 μmol·m-2·s-1，光照时间为8:00-18:00，温度为25 ℃，相对湿度为50%±10% 。设正常水分处理(土壤相对含水量70%左右)和干旱处理(土壤相对含水量35%～50%)。选择生长一致的盆栽小麦从开花后3 d开始，隔日称重控制水分，干旱期间利用土壤养分，不另施肥。小麦自然成熟后对株高、穗长、穗粒数、千粒重以及地上生物量进行考察[22]。

1.9 数据分析

利用t-test方法对数据进行分析，数据处理采用Microsoft Excel 软件，采用GraphPad Prism8进行绘图。

图1 转基因再生苗和再生根的培养Fig.1 Culture of transgenic regenerated seedling and regenerated roots

2 结果与分析

2.1 转基因小麦鉴定与获得

将RD29A:DREB1A转入受体品种陇春30中后，经过分化和筛选，共获得287株再生植株(图1)。利用RD29A启动子扩增引物F端以及MYC的R端引物对移栽成活T0代转基因小麦进行转基因鉴定。PCR检测结果表明，T0代转基因材料共有15株检测到目标条带。进一步通过Southern检测，筛选到3株单拷贝插入的T0代转基因小麦，分别命名为L4、L17和L31(图2B)。同时利用RD29A启动子扩增引物F端以及载体的R端引物进行PCR扩增检测外源基因的插入，结果显示，陇春30没有检测到条带，而L4、L17和L31三个转基因家系均检测到外源转基因的插入(图2C)。为了进一步检测外源基因是否能够在转基因小麦中成功表达，利用MYC抗体对受体品种陇春30及L4、L17和L31三个转基因家系进行了蛋白水平的检测，以ACTIN蛋白作为内参。在陇春30、L4、L17以及L31中都检测到ACTIN蛋白的表达。而利用MYC抗体检测结果表明，在陇春30中并没有检测到MYC信号，而L4、L17以及L31三个转基因家系均检测到了MYC蛋白的表达(图2D)。以上结果说明，L4、L17以及L31三个转基因家系中DREB1A蛋白能够成功表达。

已有研究表明，RD29A启动子是一个盐、温度以及干旱特异诱导的启动子[13]。因此，为了进一步验证L4、L17以及L31三个转基因家系中RD29A驱动的DREB1A在干旱胁迫下的表达模式，将L4、L17以及L31三个转基因家系幼苗在人工气候室进行干旱处理，对DREB1A基因的表达进行了检测。在干旱处理12 h后，L4、L17以及L31三个转基因家系中，DREB1A都表现出极强的干旱诱导表达。相比于未干旱处理，干旱胁迫下DREB1A的表达增强了6～7倍(图2E)，说明L4、L17以及L31三个转基因家系中，DREB1A基因的表达受干旱诱导。以上结果表明，L4、L17以及L31三个转基因家系中RD29A:DREB1A基因成功导入，并且在干旱诱导下能够成功表达外源DREB1A蛋白。因此，后续对L4、L17以及L31三个转基因家系可进一步进行纯合家系的筛选。

a:RD29A启动子和 DREB1A基因的克隆。B: RD29A:DREB1A转基因植株Southern检测。箭头指示为Southern检测条带。C: RD29A:DREB1A转基因植株PCR鉴定。D: RD29A:DREB1A转基因植株蛋白表达检测。ACTIN作为内参。E: RD29A:DREB1A转基因植株 DREB1A基因表达检测。ACTIN作为内参。正常生长幼苗作为对照，对照表达量设定为1。非转基因受体品种陇春30作为对照(WT)。

2.2 转基因家系纯合材料的鉴定

将L4、L17及L31三个转基因家系从T1代繁殖得到T2代，利用载体特异引物从T2代中利用PCR鉴定出9株阳性单株并繁殖到T3代，再从T3代中分别挑取24株幼苗继续鉴定，检测没有分离则认为该家系为纯合家系。利用PCR鉴定方法，分离出L4-3-2、L15-5-7以及L31-4-7三个转基因纯合家系(图 3)。

1～24代表转基因植物PCR鉴定条带。M：DNA分子量标准。

2.3 转基因小麦的生理抗旱性

2.3.1 转基因小麦的脯氨酸和可溶性糖酸含量对干旱胁迫的反应

与正常供水对照相比，在干旱处理下，陇春30及转基因纯合家系L4-3-2、L15-5-7和L31-4-7的脯氨酸和可溶性糖含量均显著增加， 但三个转基因纯合家系的脯氨酸和可溶性糖酸含量的增加幅度要显著高于陇春30(图4A和图4B)，表明转基因家系在干旱胁迫下具有更强的渗透调节 能力。

**表示干旱条件下转基因材料与陇春30差异在0.01水平上显著(P<0.01)。下图同。

2.3.2 转基因小麦的H2O2含量、MDA含量和相对导电率对干旱胁迫的反应

在对照条件下，陇春30及三个转基因家系L4-3-2、L15-5-7和L31-4-7间H2O2含量、MDA含量和相对导电率均相近，差异均较小(图5)。在干旱胁迫下，陇春30的H2O2含量较对照提高了近4倍，而三个转基因家系中H2O2含量的提高幅度显著低于陇春30(图5A)；陇春30中 MDA含量相对于对照提高了约2.5倍，而三个转基因家系的MDA含量提升均不到1.0倍(图5B)；陇春30中相对导电率较对照增加了4倍，达到20%，而三个转基因家系的相对导电率虽然也有增加，但增加幅度明显小于陇春30(图5C)。这表明在干旱胁迫下转基因小麦的活性氧累积较少，膜脂过氧化程度轻，膜透性受干旱胁迫影 响小。

图5 转基因小麦的H2O2含量、相对电导率和MDA含量Fig.5 H2O2 content,MDA content and relative electrical conductivity in transgenic wheat

2.3.3 转基因小麦的抗氧化酶活性对干旱胁迫的反应

在对照条件下，陇春30及三个转基因家系L4-3-2、L15-5-7和L31-4-7间SOD、CAT和POD活性均相当(图6)。在干旱胁迫下，陇春30和三个转基因家系的SOD、CAT和POD活性较对照均显著提高，但三个转基因材料的三种酶活性的提高幅度均高于陇春30(图6)，表明干旱胁迫下转基因小麦具有更强的活性氧清除能力，有利于适应干旱胁迫。

图6 转基因小麦的SOD、CAT和POD活性Fig.6 Activities of SOD,CAT and POD in transgenic wheat

2.4 转基因小麦产量性状考察

在对照条件下，三个转基因家系的株高、穗长、穗粒数、千粒重以及地上生物量较受体品种陇春30均略微降低(表1)。但在干旱胁迫下，所有材料的各指标均较对照有所下降，但相比于陇春30，三个转基因家系株高、穗长、穗粒数、千粒重和地上生物量分别增加6%～7%、7%～8%、 10%～12%、9%～12%及9%～12%(表1)，说明RD29A:DREB1A外源基因的导入对小麦的生长发育影响并不十分明显，但在干旱胁迫下，转基因小麦的农艺性状相比受体陇春30受到的抑制效应较小，表现出较好的抗旱能力。

表1 转基因小麦产量性状考察Table 1 Investigation of yield traits of transgenic wheat

3 讨 论

小麦容易受到干旱环境的影响，导致产量降低。利用转基因技术将外源基因导入小麦进行遗传改良，能够极大地加速小麦的育种进程。作物的产量是一个比较复杂的性状。作物产量的提高是作物遗传改良的主要目标。在本研究中，通过转基因技术将拟南芥基因RD29A:DREB1A转入到受体品种陇春30中，筛选获得抗旱性强、产量高且没有明显生长发育表型的纯合转基因家系，为培育抗旱小麦品种奠定了基础。

DREB蛋白在提高植物抗逆中起着重要作用[6,12,23-26]。DREB基因能够明显提高小麦对干旱和逆境胁迫的抗性[27-30]。然而由于DREB作为一个重要转录因子，可能通过调控多个途径的基因表达而参与到其他生物学过程中，通常利用CaMV35S驱动DREB所得到的转基因植株可能由于过量异位表达DREB导致转基因植物的生长发育表型受到影响[31]。因此DREB的本底表达量和干旱胁迫的特异响应表达量对于利用DREB转基因的作物改良起到非常重要的作用。目前已经在多种植物利用特异诱导型的启动子诱导DREB的表达进行转基因，使得转基因植物抗旱抗逆境胁迫增强，却不明显影响植株生长发育[3,7,32-33]。转基因植株中 DREB1A蛋白与对照ACTIN相比，处于较低的水平(图1D)。而在干旱胁迫下转基因植株的DREB1A转录受到了强烈的诱导(图1E)。因此，我们获得了本底蛋白表达低、但能够受到干旱胁迫特异诱导表达的转基因植株。DREB的过量表达能够影响植物的生长发育，本实验所获得的RD29A:DREB1A的转基因小麦由于本底DREB1A表达不高，生长发育没有受到太大的影响，然而却能够特异响应干旱胁迫，表现出较强的抗旱性。

干旱能够诱导植物脯氨酸以及可溶性糖的含量的增加[34-35]。植物能够通过调整细胞脯氨酸以及可溶性糖的含量改变细胞渗透压，从而适应干旱胁迫[36]。因此，脯氨酸以及可溶性糖的含量在植物抗旱过程中起到重要作用。RD29A:DREB1A转基因小麦脯氨酸和可溶性糖含量在干旱胁迫下显著高于野生型，表明RD29A:DREB1A转基因小麦在干旱胁迫下具有更强的调节细胞渗透压的能力(图4)。

MDA是细胞体内脂质过氧化的标记物[37]。H2O2含量以及MDA含量升高能够导致细胞膜的损伤。干旱胁迫处理能够诱导H2O2以及MDA的含量升高，导致细胞膜结构损伤。细胞膜结构损伤会引起相对导电率的变化。 在干旱胁迫下，RD29A:DREB1A转基因小麦的H2O2含量、MDA含量和相对导电率相比野生型都有显著下降，表明转基因小麦在干旱胁迫下细胞膜的损伤程度低于野生型(图5)。

干旱胁迫导致细胞内的活性氧水平上升[38]。活性氧的积累对植物细胞造成损伤[39]。植物在干旱胁迫下对细胞内活性氧的清理可增强抗旱作用。SOD、CAT和POD在清除细胞过量活性氧的过程中起到重要作用。RD29A:DREB1A转基因小麦的SOD、CAT和POD在干旱胁迫下表现出更强的活性，说明转基因小麦在干旱胁迫下具有更强的清除活性氧的能力(图6)。以上结果表明，在干旱胁迫下RD29A:DREB1A转基因小麦通过增强细胞渗透调节能力、减少活性氧的含量以及降低细胞受损程度，从生理水平上更加适应干旱胁迫，能够更好地维持正常细胞功能。因此，RD29A:DREB1A转基因小麦在生理水平表现出较强的抗旱能力。

本试验中DREB1A转基因是由特异启动子驱动，然而转基因植株中DREB1A具有一定的本底表达量，因此导致植株的生长发育受到轻微的影响(表1)。已报道RD29A:DREB1A转基因番茄的生长表型也受到轻微的影响[3]。但是由于RD29A:DREB1A外源基因受到干旱的特异诱导，因此转基因植株在干旱胁迫下表现出更强的抗旱能力，使产量性状得到改善。这表明利用RD29A:DREB1A外源基因能够更好地替代CaMV35S强启动子，使得转基因小麦既能提高抗旱能力，又能维持自身正常生长发育。

4 结 论

在本试验中，我们利用了拟南芥RD29A:DREB1A外源基因基因对陇春30进行遗传改造，所获得的纯合转基因家系在生理水平对干旱有更强的抗性，同时能够改善干旱胁迫下的产量性状，并且对植物自身发育影响较小，为小麦选育抗旱胁迫相关品种奠定了基础。

干旱胁迫是一个复杂的生理过程，植物通过多个基因在不同的层次响应干旱胁迫，通过单基因的导入并不能够完全实现对作物抗旱的遗传改良。因此，需要不断加深抗旱分子机理研究，促进分子育种发展以全面、有效地实现品种改良和 选育。