传染性胰脏坏死病酵母展示疫苗的免疫效果评价

董莹，贺文斌，赵景壮，任广明，卢彤岩，邵轶智，徐黎明、4*

(1.上海海洋大学 水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306； 2.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070； 3.上海海洋大学 国家水生动物病原库，上海 201306； 4.黑龙江省水生动物病害与免疫重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150070)

传染性胰脏坏死病(Infectious pancreatic necrosis,IPN)是一种高致病性的病毒性疾病，主要感染虹鳟Oncorhynchusmykiss、河鳟SalmofarioLinnaeus、大西洋鲑Salmonsalar等鲑科鱼类的鱼苗和稚鱼[1]，死亡率可达到90%以上，实际生产中给鲑鳟鱼养殖业带来了巨大的经济损失[2]。传染性胰脏坏死病毒(Infectious pancreatic necrosis virus,IPNV)是IPN的病原，广泛流行于欧洲、亚洲、美国等地[3]，中国的山西[2]、山东[4]、四川[5]、云南[6]等地均有IPN暴发的报道。IPNV是无囊膜的双链RNA病毒，被归类为双RNA病毒科Birnaviridae水生双RNA病毒属Aquabirnavirus[7]，具有双节段基因组，即A片段和B片段。A片段编码VP2、VP3、VP4和VP5蛋白，B片段编码VP1蛋白[8]。VP2蛋白是IPNV的结构蛋白之一，是IPNV的重要保护性抗原[9]。

IPNV因其广泛的流行性和致病性，被许多国家列为进出口检验检疫对象。中国对于IPN尚无有效的防治药物。疫苗接种是公认的控制养殖动物疾病的安全高效途径，目前，关于IPNV疫苗的研究报道主要集中在DNA疫苗[10]、减毒疫苗[11]、灭活疫苗[12]和亚单位疫苗[13]方面，所采用的免疫方式主要为注射法。由于鱼类生活在水中，群体量大，实际生产中注射免疫可操作性较低，且不适于小鱼的群体免疫。口服免疫在实际操作中简单方便、不损伤机体，能降低动物的应激反应，可免疫不同生长阶段的水生动物。因此，制备口服疫苗预防IPNV感染具有十分重要的现实意义。

酿酒酵母能将抗原蛋白展示于酵母细胞表面，是一种理想的制备口服疫苗的载体。目前已有关于病毒的酵母展示疫苗的研究报道，如利用酵母表面展示技术(Yeast display technology)制备的传染性造血器官坏死病毒[14](infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV)和草鱼呼肠孤病毒[15](grass carp reovirus,GCRV)的口服疫苗。本课题组于2013年从中国云南某养殖场患病虹鳟体内分离获得一株IPNV，命名为ChRtm213[6]，该毒株基因型为genogroup 1，属于中国现行IPNV流行毒株[8]，本课题组前期利用酵母展示系统将IPNV ChRtm213的表面蛋白VP2展示在酵母细胞表面，构建了重组酵母疫苗株[16]。本研究中以虹鳟为试验动物，对该疫苗株诱导虹鳟免疫反应能力及保护效力进行了检测与分析，同时对不同的免疫方案进行了比较，以期为该口服疫苗的实际应用提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料

IPNV ChRtm213毒株为刘淼等[6]从云南某虹鳟养殖场中分离，并由黑龙江省水生动物病害与免疫重点实验室保存(以下简称本实验室)。虹鳟体质量为(5±1)g，购自本溪艾格莫林实业有限公司。大鳞大麻哈鱼胚胎细胞(Chinook salmon embryo cells，CHSE-214)由中国水产科学研究院长江水产研究所鱼类病害教研室曾令兵研究员惠赠，亮氨酸和色氨酸营养缺陷型的酿酒酵母菌株EBY100和酵母展示载体pYD1(Invitrogen Life Technologies，V835-01)由中国水产科学研究院黄海水产研究所黄倢研究员惠赠；IPNV酵母展示疫苗株EBY100/pYD1-VP2、空载体酵母EBY100/pYD1[16]和鼠抗IPNV VP2蛋白多克隆抗体[17]由本实验室制备保存。山羊抗鼠IgG抗体(Cy3)购自英国Abcam公司;TRIzol Reagent购自美国Invitrogen公司；One Step SYBR PrimeScript PLUS RT-PCR试剂盒(Perfect Real Time)购自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 疫苗株最佳诱导时间 通过平板划线分离法，将本实验室-80 ℃下保存的疫苗株EBY100/pYD1-VP2，用含0.01%亮氨酸的酵母氮源酪蛋白选择培养基(不含色氨酸)在平板中30 ℃下培养2 d，挑取单菌落接种于含2%葡萄糖的酵母氮源酪蛋白氨基酸液体培养基(YNB-CAA)中，30 ℃下过夜培养。将菌液离心收集酵母细胞，加入含2%半乳糖的YNB-CAA培养基混匀至细胞悬液，调整培养菌液至OD600 nm=0.5～1.0，于30 ℃下诱导表达IPNV VP2蛋白。诱导后于0、24、36、48、60 h离心收集酵母细胞。用PBS溶液洗涤酵母细胞3次，将鼠抗VP2蛋白抗体稀释1 000倍作为一抗，加入酵母细胞混匀，37 ℃下孵育1 h，使用PBS溶液洗涤细胞。将山羊抗鼠IgG抗体(Cy3)稀释500倍作为二抗，37 ℃下孵育1 h。离心收集孵育后的细胞，用PBS溶液洗涤，用于细胞免疫荧光检测和流式细胞仪分析。取少量酵母细胞滴于载玻片，置于倒置荧光显微镜下(DMi8，Leica)检测免疫荧光信号，使用Image J软件分析10个显微镜视野下IPNV VP2阳性酵母细胞比例。同时，将剩余酵母细胞用PBS制备成细胞悬液，用流式细胞分选仪(FACSAria，BD)测定细胞悬液的荧光强度，对每个样本中的10 000个细胞进行分析。

1.2.2 疫苗制备及口服免疫 将EBY100/pYD1-VP2疫苗株接种至150 mL 2%葡萄糖YNB-CAA液体培养基中扩大培养，根据“1.2.1节”的诱导方法表达VP2蛋白，离心收集酵母细胞。将诱导的新鲜酵母细胞EBY100/pYD1-VP2和空载体酵母细胞EBY100/pYD1悬于PBS中，制备成终浓度为1×1010CFU/mL的酵母悬液。将健康虹鳟随机分为5组，即疫苗株单次免疫组、疫苗株多次免疫组、空载体酵母单次免疫组、空载体酵母多次免疫组和PBS模拟免疫组，每组300尾。单次免疫组为连续口服免疫7 d，多次免疫组为单次免疫后间隔一周再次连续免疫7 d。用1% MS-222溶液轻度麻醉虹鳟后，每天口灌免疫剂量为100 μL酵母悬液。

1.2.3 免疫相关基因的RT-qPCR分析 免疫结束后第7、14、21天从各试验组随机抽取5尾虹鳟，用过量MS-222杀死，采集头肾和后肠组织。用TRIzol Reagent提取各组织总RNA，并用分光光度计分析以保证RNA的纯度和浓度。分别以提取的RNA为模板，以β-actin管家基因作为内参，使用One Step SYBR PrimeScript PLUS RT-PCR试剂盒，并根据说明书进行RT-qPCR检测，以定量分析IgM[18]、IgT[19]、CD4[20]和CD8[21]基因的表达水平，并采用2-ΔΔCT方法计算基因相对表达量，以PBS模拟免疫组的虹鳟组织RNA为空白对照。

1.2.4 中和抗体效价测定 利用中和抗体试验测定各试验组虹鳟血清中IPNV中和抗体的效价。即在免疫结束后第21、49、70天时分别从各组挑取20尾虹鳟，从鱼尾静脉采集血液，将血液于4 ℃下静置过夜至凝结，以500×g离心10 min收集血清，-80 ℃下暂时保存。将待测血清(50 μL)在96孔板上进行二倍系列稀释，与IPNV悬液(200 TCID50,50 μL)混合，加入96孔板中CHSE-214单层细胞上，15 ℃下培养1 h后换成新鲜培养基，15 ℃下培养7 d。以抑制50%细胞病变的血清最高稀释倍数的倒数作为血清中和抗体效价。

1.2.5 IPNV攻毒试验及病毒载量测定 虹鳟口服免疫结束后第14、21天，取各组虹鳟用MS-222溶液进行轻度麻醉，腹腔注射100 μL 100 TCID50/mL IPNV病毒悬液，然后置于独立的循环水养殖鱼缸中(15 ℃)，每组30尾，设3个平行。同时设置PBS模拟攻毒组。在攻毒后第14天，分别采集各组虹鳟头肾、脾脏和肝脏的组织匀浆混合后提取RNA作为模板，以β-actin管家基因作为内参，采用RT-qPCR测定疫苗株单次免疫组、疫苗株多次免疫组、空载体酵母单次免疫组和空载体酵母多次免疫组虹鳟VP1和VP2基因的表达水平，以PBS模拟攻毒组虹鳟组织RNA为空白对照。采用2-ΔΔCT方法计算VP1和VP2基因相对表达量。

1.3 数据处理

试验数据以平均数±标准差(mean±S.D.)表示。使用GraphPad Prism 5.0软件进行多因素方差分析，采用Tukey法进行多重比较，显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 疫苗株最佳诱导时间

2.1.1 酵母细胞表面VP2蛋白的细胞免疫荧光检测 通过细胞免疫荧光法检测酵母细胞表面IPNV VP2蛋白的表达情况。试验中收集不同时间点的酵母细胞，依次与鼠抗IPNV VP2多克隆抗体和Cy3标记的二抗孵育后，观察诱导酵母菌株荧光情况。结果显示，EBY100/pYD1-VP2酵母细胞在诱导24、36、48、60 h后均出现特异性红色荧光(图1)。利用Image J软件对免疫荧光镜检视野(n=10)进行分析可知，EBY100/pYD1-VP2中荧光酵母细胞比例随诱导时间延长而增加，诱导24、36、48、60 h时荧光酵母细胞比例平均值分别为12.7%、33.2%、61.5%、91.3%，且各组间荧光酵母比例有显著性差异(P<0.05)(图1)。

2.1.2 酵母细胞表面VP2蛋白的流式细胞仪分析

为进一步确定EBY100/pYD1-VP2疫苗株的最佳诱导时间，将诱导时间不同的酵母细胞分别用鼠抗IPNV VP2多克隆抗体和Cy3标记的二抗进行孵育，利用流式细胞仪对酵母荧光强度进行分析，以未诱导的酵母细胞(诱导0 h)作为阴性对照。结果显示，EBY100/pYD1-VP2酵母的荧光强度与诱导时间呈正比，0、24、36、48、60 h酵母细胞的荧光强度分别为712、351 0、712 6、11 717、14 329，且各时间点间有显著性差异(P<0.05)(图2)。

综合考虑细胞免疫荧光检测结果和流式细胞仪分析结果，本研究中选取60 h 作为EBY100/pYD1-VP2疫苗株的最佳诱导时间。

2.2 免疫相关基因的定量分析

2.2.1 RT-qPCR定量评估IgM和IgT基因表达 通过RT-qPCR定量测定各组虹鳟中头肾和后肠组织中IgM、IgT基因的表达量，以PBS模拟免疫组的虹鳟组织RNA作为空白对照。从图3可见：在各个检测时间点，EBY100/pYD1-VP2免疫组虹鳟头肾和后肠中的IgM和IgT基因表达水平均显著高于空载体酵母免疫组(P<0.05)；疫苗株多次免疫组虹鳟头肾和后肠的IgM和IgT基因表达水平显著高于单次免疫组(P<0.05)；在多次免疫后14 d，IgM和IgT基因在头肾和后肠组织的上调倍数达到最高，分别为空载体酵母多次免疫组的9.8、6.1倍(IgM)和7.9、11.7倍(IgT)。

2.2.2 RT-qPCR定量评估CD4和CD8基因表达

为评估口服酵母疫苗对介导T细胞免疫应答情况,通过RT-qPCR方法定量测定了各组虹鳟头肾和后肠组织CD4、CD8基因的表达量，以PBS模拟免疫组的虹鳟组织RNA作为空白对照。从图4可见：与空载体酵母免疫组相比，在各个检测时间点，免疫EBY100/pYD1-VP2的虹鳟头肾和后肠中CD4和CD8基因均上调表达(P<0.05)，且多次免疫组的CD4和CD8基因表达量显著高于单次免疫组(P<0.05)；在多次免疫后第21天时CD4和CD8基因在头肾和后肠组织中的上调倍数达到最高水平，分别为空载体酵母多次免疫组的8.7、7.6倍(CD4)和8.5、7.9倍(CD8)。

2.3 中和抗体效价

在免疫后第21、49、70天时，对各组虹鳟血清中IPNV中和抗体水平进行评估。从图5可见：各个检测时间点,疫苗株多次免疫组的IPNV中和抗体水平显著高于疫苗株单次免疫组(P<0.05)；在免疫后第49天时，疫苗株单次免疫组和多次免疫组虹鳟血清IPNV中和抗体效价达到最高水平，分别为32.15和39.28；在免疫后第70天时血清中IPNV中和抗体水平明显下降;空载体酵母免疫组和PBS模拟免疫组血清中未检出IPNV中和抗体。

2.4 IPNV病毒载量

利用RT-qPCR测定各组虹鳟攻毒后头肾、肝脏和脾脏混合组织样品中VP1和VP2基因表达量，以PBS模拟攻毒组虹鳟组织RNA为空白对照。从图6可见：在第14、21天时，空载体酵母免疫组虹鳟组织中VP1和VP2基因表达量均显著高于疫苗免疫组(P<0.05)，其中空载体酵母单次和多次免疫组VP1基因表达量分别为疫苗株单次和多次免疫组的95、202倍和90、280倍，空载体酵母单次和多次免疫组VP2基因表达量分别为疫苗株单次和多次免疫组的90、237倍和83、220倍；在第14、21天，疫苗株单次免疫组VP1和VP2基因的表达量显著高于疫苗株多次免疫组(P<0.05)，疫苗株单次免疫组为疫苗株多次免疫组的2.25、3.33倍(VP1)和2.67、2.80倍(VP2)。本研究结果表明，该酵母口服疫苗可使虹鳟体内的病毒载量显著降低(P<0.05)，且多次免疫具有更强的抗病毒效果，各组攻毒虹鳟未出现IPNV病理性死亡。

3 讨论

3.1 中国IPN口服疫苗研究现状

IPNV是一种高传染性、高致死率的病原体，对鲑鳟水产养殖业造成了巨大的经济损失。对鱼类病毒性疾病来说，疫苗是一种安全、高效的理想防控药物。目前全球只有挪威有一种IPN商业化疫苗为亚单位疫苗，该商业化亚单位疫苗主要针对Sp血清型IPNV，而中国现行IPNV毒株并非全是SP血清型。因此，中国IPN的有效防控只能依靠疫苗的自主研发，无法引进国外商业化疫苗。目前，渔用疫苗的免疫方式主要包括口服免疫、腹腔或肌肉注射免疫和浸泡免疫。口服疫苗可操作性强，过程简单方便，利于多次免疫，适合鱼苗的大规模免疫，可减小劳动强度，并且避免注射带来的疼痛和应激反应，尤其对于幼龄鱼，口服免疫带来的便利和安全更为显著[22]。另外，口服免疫需要的免疫剂量远远低于浸泡免疫，降低了经济成本[23]。本研究领域已见口服免疫预防IPN的报道，并取得了一定的效果。如张英[24]利用植物乳杆菌制备了IPNV(Sp血清型)VP2-VP3重组亚单位口服疫苗，Ahmadivand等[25]采用壳聚糖/三聚磷酸盐(CS-TPP)纳米颗粒和海藻酸盐包被IPNV(Sp血清型)核酸疫苗制备了口服疫苗。

3.2 IPN酵母展示疫苗的免疫效果评价

酵母表面展示系统是可以将外源蛋白展示在酵母表面的一种真核细胞表达系统，主要包括a凝集素和α凝集素展示系统，外源蛋白通过结合酵母细胞壁蛋白形成融合蛋白锚定并表达于酵母细胞表面[26]。酿酒酵母能将抗原蛋白展示于酵母菌表面，是一种较好的制备口服疫苗的载体[27]。口服疫苗通过胃肠黏膜进行抗原递呈，能有效地诱导黏膜免疫和全身的免疫应答，产生免疫保护作用[28]。IgM和IgT免疫球蛋白在保护性免疫中起着重要作用[18]。

CD4+和CD8+T细胞是消除细胞内病毒感染的最重要免疫手段[21]。目前相关研究中，Zhu等[29]利用酵母细胞表面展示技术成功地在酵母菌表面表达了哈氏弧菌的血溶素，口服免疫鱼类保护率可达60%。Zhao等[14]通过改进的酵母表面展示技术研发了IHNV口服酵母疫苗，该重组酵母可刺激虹鳟后肠、脾脏和头肾中IFN-1、Mx-1、IgM、IgT、CD4和CD8上调表达，保护率为48%。以上结果均表明，将目的蛋白展示于酵母细胞表面然后口服免疫试验动物可起到不同程度的免疫保护作用。

目前，本课题组前期克隆了IPNV主要抗原蛋白基因VP2，将其构建到了酵母展示载体pYD1上构建了酵母疫苗株。本研究中利用细胞免疫荧光结合流式细胞仪分析技术，确定了该疫苗株的最佳诱导时间，保证所制备的酵母展示足够的VP2抗原蛋白用于虹鳟的口服免疫，结果显示，VP2蛋白的表达水平在诱导60 h后达到峰值。本课题组曾对该疫苗株的最佳诱导时间进行了探索，所设置的最长诱导时间为48 h，且发现诱导48 h的酵母VP2蛋白表达水平显著高于其他时间点。本研究中，笔者进一步延长诱导时间至60 h，结果表明，表达VP2的酵母细胞比例显著提高，且达到90%以上，完全能够满足试验需求。因此，本研究中选择60 h为该疫苗株的最佳诱导时间。

为了建立合理的口服给药方案，本研究中通过单次免疫和多次免疫两种方式对虹鳟进行接种试验，根据免疫相关基因表达量、中和抗体效价分析结果，探讨了多次免疫能否比单次免疫引起更强的免疫应答。本研究中选择对IgM、IgT、CD4和CD8基因进行定量分析以揭示免疫反应与该口服疫苗的关系，结果表明，疫苗株免疫组的虹鳟体内上述基因均显著上调表达，且多次免疫组的IgM、IgT、CD4和CD8基因上调程度显著高于单次免疫组，疫苗株多次免疫组的虹鳟也具有更高的IPNV中和抗体效价。此外，病毒载量测定方法目前已广泛应用于IPNV疫苗保护效果评价研究[30-31]。因此，本研究中也利用该方法评价该口服疫苗的免疫保护效果，结果表明，疫苗株多次免疫组的病毒载量较单次免疫组低，且与预期相符。

本研究中充分证明了所构建的IPN酵母口服疫苗能刺激虹鳟非特异性免疫和特异性免疫反应并显著降低虹鳟体内IPNV病毒载量，且多次免疫比单次免疫具有更好的免疫保护效果。该结果可为IPNV新型口服活载体疫苗的研发提供数据资料，同时为鱼类口服疫苗的开发提供科学参考。口服疫苗能减小动物的应激反应，操作简单方便，但同时口服免疫易受到胃肠道酸碱度、蛋白酶及微生物的影响，从而降低疫苗的免疫效果。因此，今后还需进一步探索以保证口服疫苗保护效力的稳定性。