纯净水和碱性天然矿泉水对维甲酸诱导的大鼠骨质疏松影响的比较

周洁心, 王志媛, 蔡圣宝

(1.昆明理工大学 农业与食品学院,云南 昆明 650500；2.云南天外天天然饮料有限责任公司,云南 昆明 650500)

随着人们生活质量的提高，人们对健康越来越崇尚，对水的要求也越来越高.市面上水的种类很多，纯净水，矿物质水，碱性矿泉水等.根据WHO饮用水指南报告，长期饮用去矿物质水可能对人类健康具有一定的潜在风险[1-2].相较于纯净水，一方面矿泉水中的矿物元素，特别是一些微量元素可以补充人体所需，另一方面矿泉水中的矿物元素可以使得水体呈饱和状态从而减少加工和包装过程中有害物质的渗入.人体是由多种元素组成的，根据元素在体内含量的不同又分为宏量元素及微量元素2大类.微量元素的含量虽然低，但是对人体却至关重要，一些微量元素是酶不可缺少的辅酶因子，同时还参与了体内各项激素的调节[3].有研究表明长期饮用纯净水会使得青年男性的血清脂质分布趋向病理性不良变化，升高其动脉粥样硬化指数，而饮用天然水则不会[4].另外，水中的矿物元素的组成和含量也会极大地影响到水的pH值.据一项2008年对我国24款常见瓶装水的调查发现，市面上常见的瓶装水pH差异较大，其中纯净水pH在5.5左右，天然矿泉水pH在6.9左右.另据报道，通常美国绝大部分的自来水和瓶装水等饮用水的pH都在6.7～7.4[5].虽然目前有人群研究表明碱性天然矿泉水可以降低骨吸收，并且发现碱性富含钙的矿泉水比酸性富含钙的矿泉水具有更好的降低骨吸收作用，有利于骨健康[6-7].但关于长期饮用纯净水和碱性天然矿泉水对维甲酸引起的大鼠骨质疏松症是否存在不同影响的比较研究却较少.因此，本文主要目的就是初步比较研究长期饮用纯净水和碱性天然矿泉水对维甲酸引起的大鼠骨质疏松症的影响.

1 实验材料与方法

1.1 药品与试剂

纯净水 (pH 6.0±0.5) 和碱性天然矿泉水 (pH 9.3±0.6) 均为市售瓶装饮用水.维甲酸(纯度>98%)，购于源叶生物.碱性磷酸酶，血清钙、磷测试试剂盒购于南京建成生物工程研究所, 其他试剂均为分析级.

1.2 动物实验设计

12只体重为 230 g 左右的SPF级雌性大鼠购于成都达硕实验动物有限公司，动物合格证号为SCXK(川)2015-030.具体饲养条件为：饲养温度(22±2)℃，全天通风，自由饮水和饮食.适应1周后，将大鼠禁食 12 h 后，记录初始体重，按体重将大鼠随机分为2组，分别为纯净水组和碱性天然矿泉水组，每组6只.各组大鼠均连续2周灌胃维甲酸(0.5%羟甲基纤维素钠助溶)诱导骨质疏松，灌胃剂量为 75 mg/kg，灌胃体积 5 mL/kg.2周后停止给予维甲酸，继续饲养3周后，禁食 12 h 记录最终体重，然后通过断颈法处死所有大鼠，摘除每只大鼠的肝、脾、肾以及卵巢，并记录重量，并分离出股骨骨骼.

1.3 血清钙、磷含量及碱性磷酸酶活性测定

用含肝素锂的真空采血管收集血液，3 500 r/min 转速下 4 ℃ 离心 5 min 后取上清液，即血清.按照试剂盒的操作指示，测定每只大鼠的血钙、血磷含量及碱性磷酸酶活性.

1.4 股骨的相关指标测定

取右后侧股骨，剔除周围的肌肉组织，浸泡于固定液(4%多聚甲醛溶液)中，用于进一步分析和组织形态学观察.右侧股骨的皮质骨和骨小梁利用高分辨(分辨率:48 mm)Micro-CT(LCT-200，Hitachi Aloka Medical. Ltd. Tokyo, Japan)进行扫描分析，扫描的X线能量为 50 KV，0.5 mA；相关的骨系数包括松质骨密度(Cancell-BMD)、皮质骨密度(Ct-BMD)、总骨密度(T-BMD)、皮质骨厚度(Ct-Th)、骨小梁面积(Ct-Ar)和骨极距(polar moment).

1.5 股骨的组织形态学测量

将固定的右后侧股骨浸泡于脱钙液中，脱钙4周后经梯度乙醇脱水和石蜡包埋后，分别沿横向和纵向两个方向切成 5 μm 厚的切片，用于相应的染色.其中，横切的股骨用于H&E染色(苏木精和伊红染色)和TRAP染色(抗酒石酸酸性磷酸酶染色)来观察骨小梁和破骨细胞；纵切的股骨也用H&E染色来观察皮质骨.

1.6 数据分析

所有的数据经Origin 8.5 软件处理后，结果均以平均值加减标准差的形式呈现，并用单因素方差分析Tukey检验评估组间显著性差异(p<0.05).

2 结果与分析

2.1 体重和脏器指数

大鼠初始体重、终体重、肝、脾、肾和卵巢指数(见表1).由表1可知，在实验开始时，2组大鼠的体重没有显著差异(p>0.05)，在实验结束的时候，2组大鼠的体重也没有明显差异(p>0.05).脏器指数是指某种脏器与体重之比，用于评价各脏器受损的程度[8].由表1可知，2组大鼠的肝、脾、肾和卵巢指数均无明显差异(p>0.05)，说明纯净水和碱性天然矿泉水在该实验期内对大鼠各脏器没有明显的差异影响.

表1 不同饮水组中大鼠的体重及脏器指数

2.2 血清Ca、 P、 ALP的含量

钙是1种重要的营养物质，在大多数新陈代谢过程中都有参与，磷酸盐则为骨骼和牙齿提供了机械刚性，而人体99%的钙都存在于骨骼和牙齿中，并且骨骼中的钙处于动态平衡中，其对维持血钙是十分重要的[9].如表2所示，碱性天然矿泉水组血清钙浓度为(1.54±0.09)mmol/L,稍高于纯净水组(1.53±0.10)mmol/L，但二者之间没有显著性差异(p>0.05).血清中磷的含量也表现出了与血钙相同的趋势，纯净水组血清磷浓度为(2.90±0.05)mmol/L，碱性天然矿泉水组为(2.94±0.07)mmol/L，二者之间仍没有统计学上的显著差异(p>0.05).碱性磷酸酶(ALP)是一组特异性的磷酸酯酶，几乎存在于所有生物体中，人体中骨、肝脏和肾脏中均含有[10].在分子生物学研究中，ALP常作为检测骨骼健康的血清标志物，如在骨折愈合期、骨软化症、佝偻病以及骨质疏松等疾病中，ALP的活性会显著升高[11].如表2所示，纯净水组和碱性天然矿泉水组的ALP浓度分别为(27.69±0.64)U/L和(26.99±1.13)U/L，就平均值而言，碱性天然矿泉水组ALP活性较纯净水组降低了约2.5 %，但二者之间并没有统计学上的显著差异(p>0.05).

表2 不同处理组中大鼠的血磷 (P)、血钙 (Ca) 和碱性磷酸酶 (ALP) 结果

2.3 股骨相关指标的CT结果

骨骼的骨质包括骨密质和骨松质，其中骨密质又叫皮质骨，致密且坚硬，抗压力强；而骨松质又叫松质骨，是骨骼内在骨小梁的支撑下所形成的不规则立体网状结构[12].图1是Micro-CT的扫描结果，a为皮质骨，b为松质骨.如图1a所示，碱性天然矿泉水组的皮质骨厚度较纯净水组厚度稍厚，且纯净水组骨内腔边缘明显锯齿化.从表3的结果可以看出，碱性水组的皮质骨厚度(Ct-Th)显著高于纯净水组的Ct-Th，增加了约8.6%(p<0.05).表3中皮质骨密度(Ct-BMD)的分析表明碱性天然矿泉水组的Ct-BMD虽然平均值稍高于纯净水组，但没有统计学上的显著差异(p>0.05).图1b是松质骨的扫描结果，纯净水组的骨小梁稍少于碱性天然矿泉水组.据表3中松质骨密度(Cancell-BMD)结果，碱性天然矿泉水组的骨小梁平均密度比纯净水组的提高了6.1%，但无统计学显著差异(p>0.05).另外，碱性天然矿泉水组的总骨密度(T-BMD)稍高于纯净水组，但没有统计学显著差异(p>0.05).

图1 Micro-CT对不同组中大鼠股骨的皮质骨和松质骨扫描分析

表3 不同饮水组中大鼠的股骨相关参数结果

2.4 形态组织学分析

H&E染色常用于观察组织形态是否发生损伤[13].如图2所示，a和b分别是皮质骨和松质骨的染色镜检结果.在图2a中，2个组的皮质骨都出现了不同程度的裂纹.纯净水组较碱性天然矿泉水组裂纹更加明显.图2b中松质骨的镜检结果也呈现出相同的趋势.纯净水组的骨小梁稍微变薄且出现了裂纹，骨小梁之间的间距增大；碱性天然矿泉水组的骨小梁也出现了裂纹，但是损伤程度要稍轻于纯净水组，且骨小梁间距较纯净水组稍窄.另外，由表3的结果可知，碱性天然矿泉水组的骨小梁平均面积比纯净水组的增加了约4.2%，但没有显著差异 (p>0.05).皮质骨质地坚硬主要起支撑人体的作用，而骨小梁按照骨所承受的压力和张力的方向排列，具有较高的骨扭转能力[12].由于皮质骨厚度和骨小梁面积的变化，骨极距(Polar moment)也发生相应的变化.表3显示骨极距的变化趋势与皮质骨和松质骨的趋势基本一致，碱性天然矿泉水组的平均骨极距比纯净水组的增加了2.7%，但未表现出统计学上显著差异(p>0.05).

图2 不同饮水组中维甲酸诱导的骨质疏松大鼠股骨的皮质骨和松质骨的形态学分析

2.5 破骨细胞的分析

骨质疏松症是最常见的代谢性骨病，主要是由于控制骨形成的成骨细胞和控制骨吸收的破骨细胞之间的失衡造成的，并伴有骨量减少，骨微结构改变和脆性骨折发生[14].如图3所示，股骨中的破骨细胞被染成橘红色，天然碱性矿泉水组的破骨细胞明显少于纯净水组.据表3的定量结果可以看出，纯净水组的破骨细胞数量显著高于天然碱性矿泉水组，比天然碱性矿泉水组的多了约20.36% (p<0.05).

图3 不同饮水组中大鼠股骨的破骨细胞的染色分析(×200)

3 结语

通过对维甲酸诱导的骨质疏松雌性大鼠的体重、脏器指数、血液指标、骨骼参数及组织形态学的分析.结果表明，纯净水和碱性天然矿泉水对大鼠的体重和脏器指数没有显著的影响.碱性天然矿泉水组大鼠的血钙、血磷浓度与纯净水组没有显著的统计学差异(p>0.05).就ALP的平均值而言，碱性天然矿泉水组要好于纯净水组，但不具有显著差异(p>0.05).另外，碱性天然矿泉水组的Ct-BMD 、Cancell-BMD、T-BMD、Tb-Ar和Polar moment等骨参数的平均值均稍优于纯净水组，但同样不具有显著的统计学差异(p>0.05).但是，碱性天然矿泉水组的Ct-Th 要显著地好于纯净水组(p<0.05).同时，碱性天然矿泉水组的破骨细胞数量明显少于纯净水组(p<0.05).根据本研究结果提示，碱性天然矿泉水可能具有一定的缓解维甲酸诱导的大鼠骨质疏松症症状的作用.但是，由于大鼠和人在生理代谢上存在一定的差异，因此，碱性天然矿泉水对人骨质疏松是否具有一定缓解作用还需要后续大量的人群临床研究证实.