滇黄精多糖的提取工艺及其抗氧化活性研究

李智敏,石 瑶,赵纯希,于丽娟,张易莲,张 庭,李晚谊,肖 丹

(1.云南省农业科学院 药用植物研究所，云南 昆明 650200；2.云南省农业科学院 农产品加工研究所，云南 昆明 650223；3.云南农业大学 热带作物学院，云南 普洱 665099)

滇黄精(Polygonatumkingianumcoll.et Hemsl in Journ)属百合科(Liliaceae)多年生草本植物，为药食同源植物.2015年版《中国药典》中记载滇黄精具有补气养阴，健脾，润肺，益肾的功效[1].前人研究报道滇黄精中富含多糖、皂苷、生物碱、黄酮、氨基酸等多种对人体有益的活性成分，多糖作为主要活性成分，具有抗肿瘤、调节免疫、抗氧化、抗动脉粥样硬化、调节血糖血脂等生理作用[2-5].黄精多糖主要包括中性多糖和酸性多糖，酸性多糖主要由甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸和岩藻糖组成，中性多糖主要由甘露糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖和木糖组成[6-7].

目前，研究中报道的应用于黄精多糖提取的方法有很多种，主要包括水提醇沉法、碱水提取法、超声波辅助提取法、生物酶提取法、闪式提取法等[8-12].各提取方法提取效果不同，都存在各自优缺点.本研究主要采用传统的水提醇沉法对滇黄精中的黄精多糖进行提取，采用正交试验设计，系统地优化提取参数，获得最佳的提取工艺，并对提取的多糖进行抗氧化性研究.此方法操作简单，对提取设备要求不高，可应用于大量提取.旨在为滇黄精多糖工业化提取和滇黄精多糖产品的开发提供一定的依据.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

QYJ旋转式切片机(上海南崛中药机械制造有限公司)；CY-500A高速多功能粉碎机(上海塞耐机械有限公司)；UV-5500紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)； R-200旋转蒸发器(BUCHI公司)；超声波清洗仪(天津奥特塞恩斯仪器有限公司)，101-2AB型电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)，DW-FL288低温冰箱(中科美菱低温科技有限责任公司).

滇黄精由云南玉溪市祥馨农业技术开发有限公司提供，经云南省农业科学院药用植物研究所张金渝研究员鉴定为滇黄精；蒽酮，葡萄糖购于国药集团化学试剂有限公司；1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH)购于梯希爱上海化成工业发展有限公司；硫酸亚铁，抗坏血酸(Vc)购于广东光华科技股份有限公司；水杨酸，过氧化氢，邻苯三酚，无水乙醇购于天津市风船化学试剂科技有限公司；盐酸购于西陇化工股份有限公司；Tris-HCl购于北京酷来搏科技有限公司(所有试剂均为分析纯).

1.2 实验方法

1.2.1 滇黄精预处理

取若干新鲜滇黄精根茎，去除表面杂质，洗净，沥干表面大部分水分，切片机切片，干燥，粉碎，过 0.301 mm 筛备用.

1.2.2 滇黄精多糖的提取和纯化

提取方法参照文献[13]，略有改动.

称取干燥的滇黄精粉末适量，1∶30料液比加入体积分数80%乙醇水浴回流脱脂2 h，过滤，再以1∶20 料液比加入蒸馏水，并在80 ℃下回流提取，过滤，滤液减压浓缩至适量，按体积比1∶5加入95%乙醇进行醇沉，4 ℃放置过夜.过滤，滤渣加适量蒸馏水溶解，并加入1/5的Sevage试剂(V氯仿∶V正丁醇=6∶1)进行脱蛋白处理，弃去中间的变性蛋白层和下层有机溶剂，取上层多糖溶液减压蒸发除去有机溶剂并浓缩，冷冻干燥制得滇黄精多糖提取物.

1.2.3 多糖含量测定

1) 葡萄糖标准曲线制备 称取干燥至恒重的葡萄糖适量，精密称定，加水溶解，转移至容量瓶配制成为质量浓度为0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液.取一定体积标准溶液分别配置质量浓度为0.01、0.02、 0.03、 0.04、0.05、0.06、0.08 mg/mL的葡萄糖对照品溶液，依次取上述标准品溶液1 mL于7支干燥洁净的试管中，以水为空白对照，在冰水浴冷却下缓慢加入4 mL 0.2%蒽酮硫酸溶液，边加边轻轻摇动试管，混合均匀，滴加完毕后置于沸水浴中反应10 min，取出后置于冰水浴中冷却10 min，取出，待恢复至室温后，测定吸光度，检测波长为582 nm.以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程为y=10.115x+0.0427，R2=0.997.

2) 供试品的测定方法 准确移取样品溶液1.0 mL，按照1.2.3下1项操作进行吸光度测定.

3) 滇黄精多糖含量计算 采用硫酸-蒽酮对滇黄精多糖的含量进行测定，计算公式为：

其中，ρ为测得多糖的质量浓度(mg/mL)；D为稀释倍数；V为多糖溶液的体积；m为称取的滇黄精质量(mg).

1.2.4 单因素试验

1) 料液比 当固定提取时间为2 h，提取次数为1次，提取温度为80 ℃时，试验研究料液比对滇黄精多糖提取率的影响，每组平行3次.

2) 提取时间 当固定料液比为1∶20，提取次数为1次，提取温度为80 ℃时，试验研究提取时间对滇黄精多糖提取率的影响，每组平行3次.

3) 提取次数 当固定料液比为1∶20，提取时间为2 h，提取温度为80 ℃时，试验研究提取次数对滇黄精多糖提取率的影响，每组平行3次.

4) 提取温度 当固定料液比为1∶20，提取时间为2 h，提取次数为1次时，试验研究提取温度对滇黄精多糖提取率的影响，每组平行3次.

1.2.5 正交试验

研究以滇黄精多糖提取率为指标，根据单因素试验结果，确定影响因素的范围，考察料液比、提取时间、提取温度中对滇黄精多糖提取率的影响，设计正交试验，其因素水平设计表如表1.

表1 因素水平设计表

1.2.6 滇黄精多糖抗氧化活性测定

1) 对DPPH自由基清除能力 参照文献[14]中的方法并略作修改.称取适量的DPPH，配制成0.04 mg/mL的DPPH溶液(无水乙醇配制).分别取0.4、0.8、1.2、1.6、2 mL多糖溶液(10 mg/mL)稀释到2 mL，加入2 mL DPPH溶液，混合均匀，室温避光放置反应30 min，反应结束后以6 000 r/min的转速离心5 min，取上清液测定吸光度，检测波长为 517 nm，Vc为阳性对照.DPPH自由基的清除能力计算公式为：

其中，A0为蒸馏水代替样品吸光度；A1为样品吸光度；A2为无水乙醇代替DPPH吸光度.

2) 对超氧自由基清除能力 参照文献[15]的方法并略作修改.取3 mL浓度为50 mmol/L Tris-HCl于试管中，于25 ℃水浴下保温放置20 min，随后分别加入1 mL不同浓度的滇黄精多糖溶液以及0.2 mL浓度为5 mmol/L邻苯三酚溶液，混合均匀，25 ℃避光放置5 min，加8 mmol/L HCl溶液1 mL终止反应，测定吸光度，检测波长为325 nm，Vc作为阳性对照.超氧自由基清除能力计算公式为：

其中，A0为蒸馏水代替样品吸光度，Ax为样品吸光度.

3) 对羟基自由基清除能力 参照文献[16]中的方法并略作修改.分别取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8，1 mL滇黄精多糖溶液(10 mg/mL)于试管中，并加蒸馏水稀释到1 mL，依次加入9 mmol/L硫酸亚铁溶液、9 mmol/L水杨酸溶液(乙醇配制)、 8.8 mmol/L过氧化氢各1 mL，混合均匀，37 ℃下保温反应 30 min，于510 nm处测定吸光度，用Vc作为阳性对照.羟基自由基清除能力计算公式为：

其中，A0为蒸馏水代替样品吸光度，A1为样品吸光度，A2为蒸馏水代替过氧化氢吸光度.

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比

由图1可看出，当料液比在1∶10～1∶50之间变化时，滇黄精多糖的提取率出现先增大后减小，并在1∶30处取得最大值，故本研究将1∶30作为正交试验中料液比的中心点.

图1 料液比对滇黄精多糖提取率的影响

2.1.2 提取时间

由图2可看出，随着提取时间的延长滇黄精多糖的提取率出现先增大再减小后趋于稳定的趋势，并且当提取时间为2 h时达到最大值，出现这种现象的可能原因是前期随着时间延长，滇黄精多糖不断溶出，提取率不断增大，但是过长时间的高温环境容易导致多糖结构被破坏，因而后一段时间多糖提取率显著下降后趋于平稳.故本研究将2 h作为正交试验中提取时间的中心点.

2.1.3 提取次数

由图3可看出，随着提取次数的增加，滇黄精多糖提取率的变化并不明显，说明提取次数对于滇黄精多糖的提取率影响不显著，综合考虑时间及价格成本，将提取次数定为1次.

图2 提取时间对滇黄精多糖提取率的影响

图3 提取次数对滇黄精多糖提取率的影响

2.1.4 提取温度

由图4可以看出，在60～80 ℃内，随着提取温度的升高，滇黄精多糖的提取率不断增大，当温度超过80 ℃，多糖提取率反而下降.探究其原因，可能是在60～80 ℃这个温度段内，温度升高会导致分子运动加快，分子间的相互碰撞增加，从而促使多糖的溶出增加，但是当温度过高时，高温会使多糖中的糖苷键遭到破坏，使得提取率降低.故本研究将80 ℃作为正交试验提取温度的中心点.

2.2 正交试验结果与分析

根据单因素试验结果，选择料液比、提取时间、提取温度这3个对滇黄精多糖提取率影响较大的因素进行正交试验设计，正交试验结果和方差分析结果如表2、表3所示.

根据正交试验及方差分析结果可以得出当以滇黄精多糖提取率为指标时，3个因素对提取率的影响大小顺序为：提取温度C>料液比A>提取时间B，最佳提取工艺为A1B2C2，即料液比为1∶20，提取时间为2 h，提取温度为80 ℃.

2.3 验证试验

按照正交优化的最佳工艺对3份滇黄精样品进行多糖提取，结果测得多糖的提取率分别为13.06%、13.35%、13.28%，RSD为1.14%，结果表明该提取工艺无显著性差异，重复性良好，可行.

表2 L9(34)正交试验结果

表3 方差分析

2.4 抗氧化性测定结果

2.4.1 对DPPH自由基的清除效果

由图5可知，Vc质量浓度(ρ)为0.8 mg/mL时，DPPH自由基的清除率接近100%，说明Vc对DPPH自由基的清除能力强；滇黄精多糖质量浓度(ρ)为10 mg/mL时，对DPPH自由基表现出一定的清除效果，清除率为43.8%.

2.4.2 对超氧自由基的清除效果

由图6可知，滇黄精多糖质量浓度与超氧自由基的清除率呈正相关，质量浓度达6 mg/mL以后增长趋向趋于平稳；质量浓度为10 mg/mL时，清除率达50.6%；阳性对照组Vc对超氧自由基依然表现出很强的清除能力，在质量浓度为4 mg/mL时，清除率基本达100%.与DPPH自由基相比，相同质量浓度的滇黄精多糖对超氧自由基表现出更好的清除能力.

2.4.3 对羟基自由基的清除效果

由图7可知，在质量浓度0.4～0.8 mg/mL内，阳性对照Vc对羟基自由基的清除能力不断增强，质量浓度为0.8 mg/mL时清除率基本已接近100%，表现出很强的清除能力.滇黄精多糖对羟基自由基的清除表现出浓度越高，清除能力越强，质量浓度为10 mg/mL时，清除率高达87.3%.与DPPH自由基和超氧自由基相比，相同浓度的滇黄精多糖对羟基自由基的清除能力更强.

图5 滇黄精多糖对DPPH自由基的清除曲线

图6 滇黄精多糖对超氧自由基的清除曲线

图7 滇黄精多糖对羟基自由基的清除曲线

3 结语

滇黄精是食药同源的多年生草本植物，其分布广泛，同时具有多种药理作用，受到研究者越来越广泛的关注.但由于滇黄精的品种、产地、多糖组成等不同，各研究中报道的多糖含量及生物活性表现出较大差异.本研究以产自云南玉溪的滇黄精为原料，对其中滇黄精多糖的提取工艺进行优化，通过正交试验得出其最佳提取工艺为：料液比为1∶20，提取时间为2 h，提取温度为80 ℃，在最佳工艺条件下提取率可达13.34%，可以用于放大试验中滇黄精多糖的提取.同时，体外抗氧化实验结果表明，所提取的滇黄精多糖对DPPH自由基，超氧自由基以及羟基自由基均表现出一定的清除能力，且多糖质量浓度和清除能力之间有一定的量效关系.在多糖质量浓度相同时，其对羟基自由基的清除效果最好，达87.3%，而对DPPH自由基的清除能力较弱，为43.8%.抗氧化性研究结果与已有报道的研究结果[15,17]存在一定差异，可能原因是滇黄精产地、种类以及提取工艺的不同，这对于以后研究滇黄精的品种和产地、滇黄精多糖提取工艺、抗氧化性以及它们之间的关系提供一定的参考.