不同氮肥处理对慈竹笋生长发育的影响

谈佳瑞，陈宇鹏，徐 刚，任 鹏，曹 颖，胡尚连

（1.西南科技大学植物细胞工程实验室，四川 绵阳621010；2.四川省生物质资源利用与改性工程技术研究中心，四川 绵阳621010）

慈竹（Bambusa emeiensis）是西南地区重要的经济竹种，因其具有生长周期短和高纤维素含量而备受科学工作者的重视，是竹浆造纸的良好原料。但由于生产中慈竹栽培管理粗放、产量和质量低，难以满足造纸工业对原料的需求。有研究表明，不同形态氮肥即硝态氮肥、铵态氮肥和酰胺态氮肥对植物的生长发育和产量的作用有差异。代新俊等［1］对强筋小麦的施肥研究结果表明，相较于硝态氮和铵态氮，酰胺态氮中氮（150 kg·hm-2）能够显著提高小麦的产量，在高氮（225 kg·hm-2）条件下能显著提升强筋小麦的品质。韩世洁等［2］对白羊草施氮研究表明施入60 kg·hm-2白羊草的产量最高达到13.5 t·hm-2，在此条件下白羊草的粗蛋白质、粗脂肪、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维含量最佳。扶艳艳等［3］对冬小麦研究中表明，施用3种形态氮肥，以硝态氮肥对冬小麦产量和生物量的提高最为明显。但是对于慈竹的研究以往主要集中在基因克隆、表达和纤维形态。龚道勇等［4］对慈竹bZIP基因的克隆表达以及胡尚连等［5］对慈竹理化性质和纤维形态的研究，而不同形态氮肥对慈竹笋生长发育影响的研究鲜见报道。研究以慈竹为材料，通过施用3种形态的氮肥，研究不同形态氮肥对慈竹笋生长和发育的影响，以及对慈竹茎秆产量的作用效应，为慈竹合理施肥、提高慈竹产量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在西南科技大学生命科学与工程学院资源圃内，未经处理、长势均一、生长健康、无病虫害的慈竹林。

1.2 试验设计

2015年6月和2016年的6月，连续2 a对慈竹林进行不同形态氮肥施肥处理。

以竹丛为中心，在距离竹丛的20 cm处挖环形沟将肥料均匀施入土壤中。2015年土壤基础肥力全氮0.17%，全磷为0.05%，全钾1.42%，水解性氮87.37 mg·kg-1，速效钾60.80 mg·kg-1，速效磷0.03 mg·kg-1，pH 4.89。试验一共设计5个处理，即只施入磷肥和钾肥（CK）；施入酰胺态氮肥以及磷肥和钾肥（T1）；施入硝态氮肥以及磷肥和钾肥（T2）；施入铵态氮肥以及磷肥和钾肥（T3），每个处理3次重复。施肥中氮磷钾的比例为N∶P2O5∶K2O＝5∶2∶1，根据每根基径所需要的施肥量计算每1丛竹所需要的总的施肥量，平均每根基径施用N：1.32 g；P2O5：0.53 g；K2O：0.27 g。酰胺态氮肥为尿素，硝态氮肥为Ca（NO3）2·4H2O，铵态氮肥为（NH4）2HPO4和NH4Cl，钾肥为K2SO4，磷肥为Ca（H2PO4）2。

2016年土壤基础肥力如下：

CK处理的全氮0.15%，全磷为0.04%，全钾1.45%，水解性氮45.77 mg·kg-1，速效钾14.47 mg·kg-1，速效磷0.01 mg·kg-1；T1处理的全氮0.11%，全磷为0.04%，全钾1.50%，水解性氮50.35 mg·kg-1，速效钾21.82 mg·kg-1，速效磷0.01 mg·kg-1；T2处理的全氮0.12%，全磷为0.04%，全钾1.38%，水解性氮57.32 mg·kg-1，速效钾22.68 mg·kg-1，速效磷0.01 mg·kg-1；T3处理的全氮0.11%，全磷为0.04%，全钾1.42%，水解性氮47.99 mg·kg-1，速效钾24.44 mg·kg-1，速效磷0.01 mg·kg-1。

2016年施肥量根据公式计算：

2016年需要施入的有效氮磷钾的量＝2015年施肥前土壤中有效氮磷钾的含量+2015年施入的有效氮磷钾含量-第2次施肥前土壤中有效氮磷钾的含量。

1.3 测定方法

1.3.1 发笋量及生长量的测定 自出笋之日起记录竹笋的发笋量，直至出笋结束，傍晚竹笋高度减去当天早晨的竹笋高度即为昼生长量，早晨的竹笋高度减去前1天傍晚的竹笋高度即为竹笋的夜生长量，同时每周测量1次竹笋的基径。

1.3.2 竹笋形态解剖学方法 采用石蜡切片法，样品用改良的FAA固定液（按照95%乙醇∶冰醋酸∶37%甲醛的福尔马林∶蒸馏水＝5∶1∶1∶3进行配制）进行固定。将一部分脱蜡后的切片用浓度为0.005%的纤维荧光染料进行染色，染色清晰且形态完整的切片，在Leica DMI-3000倒置荧光显微镜下观察。

1.3.3 叶绿素含量的测度 将丙酮和无水乙醇按2∶1的比例制成95%的水溶液［6］。称取0.5 g去掉主脉的慈竹叶片破碎后于25mL试管中，加入提取液后置于生化培养箱25℃下暗提取，2 d后以提取液为对照组用分光光度计测定叶绿素含量，波长为645 nm和663 nm，Arnon计算公式为：

叶绿素a浓度（mg·L-1）：Ca＝12.7A663-2.69A645；

叶绿素b浓度（mg·L-1）：Cb＝22.9A645-4.68A663；

叶绿素总浓度（mg·L-1）：Ca+b＝Ca+Cb。

1.3.4 NR、GS、GOGTA、蔗糖合酶和磷酸蔗糖合酶测定 参照齐一生物科技（上海）有限公司试剂盒说明书步骤进行测定。

1.3.5 可溶性糖和可溶性蛋白的测定 采用蒽酮比色法测定1年生慈竹中的可溶性糖。采用考马斯亮蓝G-250染色法测可溶性蛋白的含量。

1.4 数据统计

使用Excel、SPSS等软件进行数据分析，CANOCO做主成分分析。

2 结果与分析

2.1 不同氮肥处理对慈竹竹笋生长发育和竹材产量的影响

2.1.1 慈竹发笋量 在施入的氮磷钾的比例和总量一定的时，2015年和2016年2 a的不同氮肥处理对慈竹的日均出笋量有影响。与未施入氮肥的处理相比，施入氮肥能够明显提高发笋量，以2016年的试验结果为例，酰胺态氮处理的累计日均发笋量最高，是未施入氮肥处理的123%，其次为硝态氮处理，是未施入氮肥处理的119%，铵态氮处理最低，是未施入氮肥处理的109%，但未达到差异显著水平。分析两年的竹笋发笋量，其动态变化趋势基本一致，都呈现出“S”型曲线（图1）。

图1 不同施肥处理慈竹平均每根基径发笋量动态变化Fig.1 Dynamic change of the shooting number per parent bamboo in Bambusa emeiensis

2.1.2 慈竹笋高度和基径动态变化 随着时间的推移，2015年和2016年2 a的慈竹笋的生长呈上升趋势（图1），竹笋的高度也不断增加（图2）。以不施用氮肥的竹笋的高度为基准，慈竹笋生长到45 d，最高的是铵态氮肥处理，其次为硝态氮处理，酰胺态氮肥处理最低，但均未达到差异显著水平。

慈竹竹笋直径随着时间的推移则呈缓慢增长的趋势，到第50 d时酰铵态氮肥处理笋的基径最大，其次是铵态氮肥和不施氮处理，基径最小的是硝态氮肥处理的竹笋，但各处理间也均未达显著性差异（图2）。

图2 2016年慈竹笋高度和基径动态变化Fig.2 Dynamic change of the shoot height and the average base diameter of shoots in Bambusa emeiensis in 2016

图3 不同氮肥处理的慈竹笋形态解剖特征Fig.3 Anatomical structure characteristics of Bambusa emeiensis shoots under the different treatments of nitrogen fertilizer

2.1.3 不同氮肥处理对竹笋形态解剖特征的影响不同形态氮肥处理间在导管直径、外方纤维股厚度、中心纤维束宽和相邻维管束间薄壁细胞厚度4个指标上都没有明显差异，但不同处理间的内方纤维股厚度和中心维管束高则存在显著差异。施入铵态氮肥的竹笋内方纤维股厚度和中心纤维束高都明显要高于其他处理，酰胺态氮肥处理后的竹笋内方纤维股厚度最小（图3）。

有关研究表明［7］，细胞次生壁的存在会引起双折射现象，双折射的强度也与细胞次生壁的沉积的厚度有关，次生壁木质素含量越多、沉积越厚双折射强度就会越强。与其他处理相比，铵态氮处理后竹笋维管束周围细胞的细胞壁的双折射现象很明显（图4），说明铵态氮能够促进了竹笋维管束的形成和细胞次生壁的快速形成和木质素的沉积，导致维管束的高木质化，细胞次生壁的形成和沉积的生物途径与施肥之间的关系还有待进一步研究。

图4 慈竹笋偏光显微照片Fig.4 Polarized micrograph of section in shoots of Bambusa emeiensis

2.2 不同氮肥处理对慈竹叶片相关酶活性及相关理化性质的影响

（1）硝酸还原酶。硝酸还原酶（NR）在植物中的活性高低会影响植物吸收利用土壤中无机氮，由于硝酸还原酶是一种诱导酶，所以土壤中的硝态氮（KNO3）含量的多少对硝酸还原酶的活性有很大影响［8］。硝态氮肥的施入能够显著提高慈竹完全展开叶中硝酸还原酶的活性，其次是铵态氮肥处理和不施氮处理，最低为酰胺态氮处理，且不同处理间的差异都达到极显著水平（图5A）。

（2）谷氨酰胺合成酶。氮素的同化过程对于植物的生长发育有着重要意义，硝态氮被还原成铵态氮才能被植物吸收，而铵态氮可以被转化成谷氨酰胺和谷氨酸用于合成蛋白质［9］，氮素同化过程中谷氨酰胺合成酶作为关键酶参与其中［10］。相比较于其他试验组，酰胺态氮肥和不施氮处理的谷氨酰胺合成酶的活性显著高于硝态氮肥和铵态氮肥处理组（图5B）。

（3）谷氨酸合成酶。谷氨酸合成酶（GOGAT）在植物体内以2种形式存在，分别是Fd-GOGAT和NAD（P）H-GOGAT，谷氨酸合成酶作为谷氨酸合成酶循环中的关键酶将铵态氮同化为氨基酸被植物吸收利用。结果表明：不同施肥处理间的谷氨酸合成酶活性明显存在差异（图5C）。酰胺态氮处理的谷氨酸合成酶活性最高，且明显高于其他处理；其次为不施氮处理组，最低为铵态氮肥和硝态氮肥处理组（图5C）。

图5 不同氮肥处理的慈竹叶片硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合成的活性Fig.5 Nitrate reductase，glutamyl synthtase and glutamate synthtase activity in the expanded leaves of Bambusa emeiensis treated with different kinds of nitrogen fertilization

蔗糖合酶和蔗糖磷酸合酶是蔗糖合成的2种途径［11］，不同氮肥处理间蔗糖合酶和蔗糖磷酸合酶存在显著差异（图6）。蔗糖合酶活性以铵态氮肥处理组为最高，其次为硝态氮处理，再次为酰胺态氮肥处理，不施用氮肥处理的为最低（图6A）。不同氮肥处理间的蔗糖磷酸合酶活性也明显不同，以不施氮肥处理的酶活性为最高，其次为铵态氮肥和酰胺态氮肥处理，硝态氮处理的酶活性最低（图6B）。

图6 慈竹展开叶蔗糖合酶活性和蔗糖磷酸合酶的活性Fig.6 Sucrose synthase activity and sucrose phosphate synthase in the expanded leaves of Bambusa emeiensis

（5）叶绿素与可溶性糖含量。不同氮肥处理间慈竹完全展开叶叶绿素和可溶性糖含量存在差异，但未达到差异显著水平（图7）。氮肥形态对慈竹展开叶中可溶性蛋白含量有明显的调控作用，不施氮处理组叶片中可溶性蛋白含量最高，其次是酰胺态氮肥处理，再次是硝态氮肥处理，铵态氮肥处理组叶片可溶性蛋白含量最低（图7C）。

图7 慈竹展开叶叶绿素、可溶性糖和可溶性蛋白含量Fig.7 The chlorophyll，soluble sugar and soluble protein content in the expanded leaves of Bambusa emeiensis

2.3 主成分分析

前面的结果已经表明氮肥形态对慈竹相关的生理生化指标有显著的调控作用，利用主成分分析进一步探讨其生理生化指标与发笋量之间的联系。结果表明：对比不同处理组，施入酰胺态氮肥最有利于提高发笋量，叶中的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量对发笋量呈正向调节作用。

图8 不同形态氮肥处理下生理生化指标的主成分分析Fig.8 The PCA of physio-biochemical indexes treated with different forms nitrogen fertilizer

3 讨论

慈竹产量和质量直接关系到竹浆的产量和质量。在慈竹生长发育过程中，氮素的供给直接决定慈竹的产量和利用价值，产量和质量是评定慈竹的生产性能和选育过程中的重要指标。有研究表明，不同形态氮肥直接影响植物的生长和发育［12-14］以及产量和质量［1-2］。研究结果表明，不同形态氮肥对慈竹的发笋量和基径没有显著的调控效应，但是对慈竹竹笋的发育质量有显著的影响，铵态氮肥能够显著促进竹笋维管束的形成和周围薄壁细胞次生壁的形成或沉积。

众多研究表明，氮肥会对植物叶绿素和相关酶的活性产生影响，施入一定比例的铵态氮和硝态氮会促进植物光合产物的积累［15］。与硝态氮肥相比，施入铵态氮肥能够显著提高叶片叶绿素的含量［16］。在甘蔗的研究中［17］也发现，相比于硝态氮肥，铵态氮肥能够显著提高蔗糖合酶的活性。试验研究发现，氮肥形态对慈竹展开叶中的叶绿素含量和可溶性糖含量并没有显著的影响，但是对蔗糖合酶活性和蔗糖磷酸合酶活性分别有明显的调控效应，研究表明蔗糖合酶和蔗糖磷酸合酶都与蔗糖的合成有关［10］，试验中蔗糖合酶与蔗糖磷酸合酶的活性呈大致互补趋势，这就可能造成了不同氮肥处理间可溶性糖含量没有显著性差异的结果。硝酸还原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合成酶（GOGAT）是植物氮素代谢的关键酶，GS参与多种氮素代谢是氮素代谢中心的多功能酶［18］。众多研究表明，氮素形态会影响氮代谢相关酶的活性，如王小纯等［19］对小麦的研究结果表明不同形态氮肥对NR、GS和GOGAT活性有显著影响，且GS活性和GOGAT活性与可溶性蛋白含量成显著正相关。黄勤妮等［20］对小麦的研究中发现铵态氮肥比硝态氮肥更能提高谷氨酰胺合成酶活性。试验研究发现，酰胺态氮肥和不施氮处理组GS活性和GOGAT活性与可溶性蛋白含量呈正相关，分析NR、GS和GOGAT活性与可溶性蛋白含量，推测NR、GS和GOGAT活性在合成可溶性蛋白的机理中可能存在叠加效应，但具体的机制有待进一步研究。

竹笋的生长发育主要来自于母竹生长发育和营养积累的情况，测量母竹相关的生理生化指标，有助于分析竹笋发育与母竹之间的关系。结果表明酰胺态氮肥对慈竹竹笋的生长发育有较明显的促进作用，也证明氮肥对于植物的分蘖和腋芽发生有不可替代的作用，与前人研究结果相一致［21］。此外，试验中发现氮素形态对竹笋发育质量有显著的调控作用，不同形态氮肥对慈竹材性的影响还有待进一步研究。