翅果油蜂蜜特征物的识别及应用

任彩君 赵柳微 王凯 薛晓锋 赵艳萍 吴黎明

（1 中国农业科学院蜜蜂研究所；2 山西玉浆堂蜂业科技有限公司）

1 引言

翅果油树（拉丁学名：Elaeagnus mollis Diels.）是胡颓子科胡颓子属落叶直立乔木或灌木，属国家一类保护树种，仅在中国山西和陕西两地有少量分布。翅果油树的种子、树叶等部位含有丰富的营养物质，其中树叶中不饱和脂肪酸占脂肪酸总量的77%以上，亚麻酸占不饱和脂肪酸的70%以上[1,2]。翅果油树开花早，花蜜含量大，花粉营养价值高，是一种理想的蜜源植物。

翅果油蜂蜜是蜜蜂从翅果油花中采集花蜜，并在蜂巢中充分酿造而成的天然甜物质[3]。分析发现，翅果油蜂蜜中富含维生素、脂肪酶、磷酸酶、蛋白酶、淀粉酶和蔗糖酶等人体代谢不可缺少的物质，适合补给免疫力低下人群[4,5]，同时还具有改善尿频、睡眠和调节胃肠道功能等作用[5]，是一种产量较少的优质特色蜂蜜。但目前还未形成翅果油蜂蜜特征鉴别技术，有被掺假的潜在风险，也无法从功能组分角度与其他种类蜂蜜区分。

近几年，本团队已经建立了鉴别不同蜂蜜特征与功能的成熟方法和应用模型。本研究利用代谢组学和统计学分析技术，对翅果油蜂蜜、翅果油树的花所含化合物进行异同比对，旨在探究翅果油蜂蜜中的特征识别物，提供针对翅果油蜂蜜的鉴别方法并确定蜂蜜特征物的阈值范围，为进一步开发利用翅果油蜂蜜提供技术支撑。

2 实验部分

2.1 仪器、试剂与材料

Milii-Q纯水机，美国Millinpore公司；电子分析天平，METTLER-TOLEDO公司；混合振荡器，海门市其林贝尔仪器制造责任有限公司；N-EVAP112氮气吹干仪，美国OA-SYS公司；超高效液相色谱-高分辨质谱（UHPLC-Q-TOF/MS，6545），美国安捷伦科技有限公司。

色谱级甲醇，Fisher公司；Sep-Pak C18固相萃取小柱，Waters公司；0.22µm尼龙膜，津腾公司。

分析样品：2018年、2019年从山西翼城的翅果油种植区域周边的蜂场，采集翅果油蜂蜜，共36个样品，同时采集了相同地点的翅果油树的花样品12个。实验室备存的油菜、洋槐、枣花蜂蜜各3个样品，共9个样品。

2.2 样品前处理

称取蜂蜜样品各5g，加入10ml去离子水，震荡溶解后60kHz功率超声10min。将样品加入预先用5ml甲醇和5ml纯水活化的C18固相萃取小柱，调节流速1～1.5ml/min，待样品溶液全部流出后，用10ml纯水淋洗C18小柱，负压下抽干。用8ml甲醇洗脱，收集洗脱液，常温下氮气吹干。用1ml甲醇复溶，0.22µm尼龙滤膜过滤，进样。

翅果油树的花/芽研磨成粉末，分别称取2g加入10ml甲醇，8000g离心10min，取上清液，0.22µm尼龙滤膜过滤，进样。

2.3 超高效液相色谱-高分辨质谱检测的条件

色谱条件：色谱柱Agilent Eclipse Plus C18（2.1×100mm，1.8µm）；流动相为含0.1%甲酸水溶液（A）、含0.1%甲酸乙腈溶液（B）；进样量2µl；柱温40℃；流速0.3ml/min。

质谱条件：ESI离子源；载气温度320℃；气体流速8l/min；喷雾器压力40psi；毛细管电压3500V；鞘气温度350℃；鞘气流速11 l/min；负离子扫描模式。

表1 梯度洗脱程序

3 结果与讨论

由于翅果油蜂蜜是蜜蜂采集翅果油花的花蜜并在蜂巢中经过充分酿造而成的，因此考虑翅果油蜂蜜特征物与翅果油花密切相关[6,7]。将翅果油蜂蜜与翅果油植物花中的化学组分进行对比，找到两者并存的化合物，发现共有170多种化合物，通过Metlin数据库检索，找出匹配度大于85%的化合物，作进一步筛选并利用保留时间和化合物精确质量数两个指标与标准品比对确认，α-亚麻酸标准品及蜂蜜中对应的提取离子m/z277.2173、保留时间18.2min，色谱图见图1、图2，亚油酸标准品及蜂蜜中对应的提取离子m/z279.2330、保留时间19.1min，色谱图见图3、图4。

图1 α-亚麻酸标准品提取离子m/z277.2173色谱图

图2 翅果油蜂蜜提取离子m/z277.2173色谱图

图3 亚油酸标准品提取离子m/z279.2330色谱图

图4 翅果油蜂蜜提取离子m/z279.2330色谱图

查阅文献发现，李乔等在翅果油树叶中检出α-亚麻酸[8]，宋双红等在翅果油树种子油中检出亚油酸[9]，冯宝英在翅果油树种仁中检出亚油酸[10]。本研究从翅果油蜂蜜中检出α-亚麻酸、亚油酸，表明翅果油蜂蜜与翅果油植物不同部位共同含有α-亚麻酸、亚油酸。但有研究表明，个别品种蜂蜜中也含有α-亚麻酸、亚油酸[11-13]。本研究也在油菜、洋槐、枣花蜂蜜中检出少量α-亚麻酸、亚油酸，单独以蜂蜜中是否含有α-亚麻酸、亚油酸难以判定是否为翅果油蜂蜜。

为此，我们采用定量法进一步确定了翅果油蜂蜜中α-亚麻酸、亚油酸含量，发现所有翅果油蜂蜜样品的α-亚麻酸含量均不小于100mg/kg、亚油酸含量均不小于10mg/kg，且α-亚麻酸、亚油酸的浓度比在（10～13）∶1之间，与其他蜂蜜中α-亚麻酸、亚油酸浓度比在（1～3）∶1之间，存在显著差异。因此将α-亚麻酸（≥100mg/kg）、亚油酸（≥10mg/kg）、α-亚麻酸/亚油酸浓度比（10～13）∶1，联合作为翅果油蜂蜜特征识别参数，以提高鉴别的准确性。

4 小结

本研究基于UHPLC-Q-TOF/MS技术并结合代谢组学及统计学分析手段对翅果油蜂蜜的化学成分进行分析，并结合相关文献报道确定以α-亚麻酸、亚油酸作为翅果油蜂蜜特征识别物[14,15]，且满足：α-亚麻酸含量≥100mg/kg，亚油酸含量≥10mg/kg，α亚麻酸与亚油酸浓度比在（10～13）∶1之间。利用该鉴别方法能够准确识别翅果油蜂蜜，研究方法和模型也为其他蜂蜜品种鉴别提供了可靠思路和有效办法。

同时，翅果油蜂蜜较高的α-亚麻酸和亚油酸的浓度比（10～13）∶1，也有助于调节和平衡现代膳食结构中亚油酸含量相对较高、亚麻酸含量相对较低的情况[16]，食用翅果油蜂蜜有助于人体健康。