危重新生儿遗传性疾病快速全基因组测序专家共识

危重新生儿遗传性疾病快速全基因组测序专家共识工作组

危重症患儿是遗传性疾病(遗传病)的高发人群，遗传因素导致的脏器功能衰竭是危重症患儿死亡的重要原因之一[1-3]。遗传病的临床表现在疾病早期往往不典型，尤其在NICU的新生儿中可能尚未完全显现。危重症状态下的患儿遗传病表型还可能被其他临床症状所掩盖，给病因的诊断带来困难[4, 5]。在明确诊断的过程中，这些患儿通常需要完成多种常规检测，重复采集血样，进行各种辅助检查，甚至实施侵入性操作，这不仅给患儿带来较多痛苦，也使家庭承受了很大的经济负担[6]。但即使是完成了上述各种检查，可能还是难以找到真正的致病原因。部分疾病的临床进展十分迅速，如果不能早期明确诊断，及时采取针对性的治疗措施，可能有致死、致残等严重后果。

随着分子诊断技术的发展，基因检测在遗传病的诊断中发挥越来越重要的作用[7-10]。在危重症患儿中应用现有的基因诊断技术，建立快速诊断流程，及时明确病因，可以为这些患儿争取关键的治疗时间窗，改变治疗决策，提供预后判断，影响临床转归，避免严重不良结局的发生，对患儿的诊治具有非常重要的现实意义[11]。

全基因组测序是目前检测范围最广的分子基因检测技术，针对生物体完整的基因组序列进行测序，涵盖基因组编码区和非编码区，能同步检测多种变异类型[12, 13]，由于没有捕获建库过程，整体实验流程较其他需要捕获建库的高通量测序实验更短，可以满足疑难危重症患儿需要快速诊断的需求，是非常有应用前景的技术。本共识就快速全基因组测序(WGS)在危重症新生儿群体中的应用作如下建议。

1 适用人群

存在下列危重症表现的新生儿：(1)呼吸、循环系统，①新生儿持续性肺动脉高压，②心肌病，③影响血流动力学的心律失常，④经过机械通气等常规治疗仍难以纠正的严重低氧血症；(2)神经系统：①临床病因不能解释的新生儿脑病，②频繁发作的新生儿惊厥，③不明原因的松软儿；(3)内环境及代谢相关：①难以纠正的代谢性酸中毒，②严重高氨血症，③严重的电解质紊乱，④进展性肝功能损伤、肝功能衰竭，⑤进展性肾功能损伤、肾功能衰竭；(4)免疫及血液相关：①脓毒症，②严重凝血功能障碍，③严重血小板减少，④噬血细胞综合征；(5)其他危及生命的畸形和症状。

2 不适用人群

①高度怀疑某种单基因疾病或染色体病，②存在假基因，对序列比对造成干扰；③遗传病因已明确的患儿；④家属拒绝进行检测或无法采集家系样本；⑤采血样前有输血史。

3 伦理和知情同意

快速WGS技术在临床实施的过程中必须遵循医学伦理学的基本原则[14-17]：包括但不限于尊重自主原则、有利原则、不伤害原则和公正原则。 需要强调的是，临床医生应严格把控适用人群，避免非必要或非危重症新生儿占用快速WGS检测的医疗资源。知情同意书的内容建议包括如下几方面：检测的目的和意义；检测的适应证和局限性；采集样本类型和检测方法；可能存在的风险；替代性诊断方法；患儿及其家人的信息和隐私保护；在数据分析中可能出现的二次发现结果。

4 实施流程

快速WGS测序应用于危重症新生儿病因诊断的关键点在于，能在最短时间内得到检测结果，为临床决策提供依据。因此在整个检测实施流程中需要临床和实验室相互配合，做到无缝对接。临床和实验室均需建立快速WGS检测的绿色通道，对于适用的新生儿病例提供不同于常规样本处理的快速流程(图1)。建议组建一支由新生儿、重症医学、分子医学、生物信息学和影像学等专家组成的快速WGS项目的多学科团队(MDT)，以定期例会和随时网络会议的形式，参与病例的评估、决策和管理。

5 临床医生的作用

5.1 检测前知情告知 需要向新生儿家长或监护人充分告知检测的必要性，实施检测的益处，预期的检测结果及可能存在的其他发现，得到新生儿家长或监护人的理解和认可，并签署知情同意书。

5.2 采集临床信息 详细的病史信息，完善体格检查，记录特征性的临床表型。

图1 快速WGS临床和实验室实施流程

5.3 检测后遗传咨询 根据快速WGS的检测结果，包括致病变异/可疑致病变异、临床意义未明变异、其他发现等，向新生儿家长或监护人进行结果的解释。

5.4 参加快速WGS项目MDT讨论。

6 样本采集

6.1 外周血样本 ①新生儿及其生物学的父母；②无菌注射器采集静脉血1～2 mL，放置于EDTA抗凝管(紫色盖子)中,不能使用肝素抗凝管；③标本即刻送达实验室。

6.2 组织样本 将厚度<0.5 cm的新鲜样品 (如果厚度>0.5 cm，先切薄) 浸入5～10 倍体积的 RNAlater中。将浸泡有样品的 RNAlater 置于室温下保存。

6.3 样本采集后处理 临床医生应立即通知实验室样本管理组成员，做好样本接收和实验准备，由医院运送中心专人将血样或组织样本尽快送达实验室。

7 分子生物学实验室

7.1 实验室资质 为确保第一时间启动检测，避免因多方人员接触检测所增加的管控难度，建议将整个测序实验流程部署在医院。检测医院应是经国家卫计委审核通过的高通量测序试点单位或三级以上综合性医院，拥有独立的基因检测实验室，有开展WGS和数据分析的能力。

7.2 场地 实验室功能区域划分可参考国家卫计委临检中心针对遗传病检测高通量测序实验室各功能区基本分区的原则，结合医院现有实验场地，在保证有效通风、工作有序开展、防止交叉污染的前提下，因地制宜地进行设计。

7.3 人员 开展快速WGS检测的实验室，应组建一个检测专项团队并做好应对方案，保证每例样本到达实验室后能得到及时处理，在第一时间将检测结果报告临床。

检测专项团队成员应包括：项目负责人、实验室技术员、生物信息分析员、报告解读员和遗传咨询医生等。

项目负责人：具有医学遗传学或分子生物学知识背景，全面负责整个快速WGS实验流程实施和质量控制。

实验室技术员：从事基因测序工作3年以上，熟练掌握高通量测序实验技术操作流程，具备临床检验资格证书，PCR上岗证。

生物信息分析员：生物信息学或计算机专业，外显子组数据分析3年以上从业经验，熟练使用至少1种主流编程语言，熟悉基因组学数据库的数据结构并能熟练处理必要信息。

变异评级和解读员：医学、遗传或生物学背景，高通量测序数据分析2年以上经验，具有较强英文文献阅读和综述能力，熟悉遗传病常用数据库，能对变异位点进行正确评级和解读。 包括但不限于以下工作：①结合患儿的HPO、基因变异类型、遗传模式，家系共分离情况和文献记录等，筛选候选变异位点；②位点解读中，对深度内含子区、新发剪切位置、基因调控区域变异的分析和解读需要慎重；③基因变异命名依据人类基因组变异协会(HGVS)制定的命名规则，变异评级基本原则参考美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)在2015 年制定的“序列变异解读标准和指南”[18]；④分析发现P/LP变异后，实验室应第一时间将检测结果口头报告给临床咨询医生。

8 基因检测数据分析

快速WGS检测实验应就近开展，以便第一时间展开数据分析；若需远程传输测序数据，至少要保证100 Mb·s-1的下载速度。

测序读段拼接和变异位点识别，每例样本应控制在1 h内完成。需要240个以上CPU核心并行计算，或是运用FPGA芯片加速。

变异分析应包含针对单核苷酸变异、插入缺失和拷贝数变异的分析。针对染色体结构、线粒体基因、宏基因组等变异的分析可视情况开展。

临床表型的收集和整理应符合标准规范，如ICD条目和人类表型标准术语(HPO)等。

报告解读和咨询，变异分析和解读需要由具有遗传咨询医师资质或具备遗传咨询能力的医生完成，该医生需要熟练掌握常见遗传病的发病机制、遗传模式、临床表现，能对家系遗传病再发风险进行计算和评估，并给出临床指导意见。发动MDT专家讨论，制定临床决策。

9 临床随访

利用遗传咨询和MDT联合门诊，对已完成检测的新生儿进行随访，建议设立线上专家库，共同参与MDT会诊，结合基因检测报告和临床诊断，对新生儿行进一步临床评估。

对于诊断明确的患儿，在给予针对性治疗的基础上，做好疗效评估和转归随访，对新生儿家系成员开展遗传咨询和再生育风险评估，必要时提供产前诊断建议。

对于尚未明确诊断的病例，制订随访计划，及时更新表型，在疾病数据库更新的基础上，定期对检测数据再分析，当随访新生儿出现新的有意义的临床表型时，也可以由临床医生即时申请数据再分析。

在整个快速检测实施的过程中，需要临床和实验室各司其职，密切配合，不断优化改进流程，以期达到最优的检测效果。

10 优势及局限性

存在的问题和局限性：①检测成本相对较高，因此纳入检测的新生儿病例需要有选择性。未来随着测序成本的进一步下降，WGS测序在临床诊断中的应用有望进一步拓展。②数据量大，生物信息分析和临床解读是关键，WGS不仅能检测到大量基因组编码区的变异，同时能检测到基因组深度内含子区、调控区的各种变异，对于上述变异的解释需要慎重。③染色体结构变异检测等结构分析依然存在难点，且缺乏有效的验证手段。部分染色体特殊结构区，如三碱基重复序列、假基因干扰序列等，之前认为短读长为主的WGS测序对上述类型变异检测能力有限。但是随着技术的发展、读长的增加以及算法的优化，WGS测序对于这些特殊结构区域的检测能力也在不断提升。④WGS测序深度通常在30～60 bp，对于基因组中存在的嵌合突变不能进行有效检测。

目前临床常用的分子检测技术都有其各自的针对性：①基因芯片仅能对微缺失、微重复这类不平衡的基因组拷贝数异常进行检测，但对平衡性的染色体重排、基因内点突变检测能力有限; ②基因包(Panel)为基础的二代测序技术，可以检测探针设计范围内的基因变异，但检测的基因数目相对较少; ③全外显子组测序(WES)虽然检测范围更广，但只针对基因组编码区变异进行检测，对非编码区及其他拷贝数异常或基因组结构异常检测能力有限，而且因为存在建库捕获过程，检测的周期相对较长，难以满足临床对于危重症患儿全面、快速基因诊断的需求。

快速WGS的优势：①没有对目标序列捕获建库过程，耗时较WES和基因Panel更短，在危重症新生儿遗传病病因检测中能发挥更大的作用; ②检测范围最广, 对全基因组进行测序，能涵盖基因编码区和非编码区的变异；③可以检测多种变异类型,包括单核苷酸变异、基因组拷贝数变异和染色体结构变异等；④可以对线粒体基因组变异进行分析，能诊断部分线粒体基因组突变导致的疾病；⑤可以进行宏基因组分析，对于合并重症感染的新生儿，在进行分子病因检测的同时，亦能对病原微生物进行同步分析，为临床合理使用抗生素提供重要依据。

危重新生儿遗传性疾病快速全基因组测序专家共识工作组(按姓氏笔画排序)韦秋芬(广西壮族自治区妇幼保健院)，史源 (重庆医科大学附属儿童医院)，庄德义(复旦大学附属厦门儿童医院)，李龙(新疆维吾尔自治区人民医院)，李红(江西省儿童医院)，吴冰冰(复旦大学附属儿科医院)，汤泽中(北京大学第一医院)，陈丽萍(江西省儿童医院)，周伟(广州市妇女儿童医疗中心)，周文浩 (复旦大学附属儿科医院)，杨琳(复旦大学附属儿科医院)，康文清(河南省儿童医院)，黑明燕(首都医科大学附属北京儿童医院)