北方果树果实细胞壁降解相关酶基因研究进展

刘 琦 王玉霞 李芳东 孙庆田 张福兴*

（1烟台大学生命科学学院，烟台 264005；2山东省烟台市农业科学研究院，烟台 265500）

果实成熟是一个复杂的过程，包含着高度协调的遗传调控过程。在此过程中伴随着果实的颜色、质地、气味的变化，其中果实衰老的一个重要特征就是果实的软化。有研究表明乙烯是果实衰老的重要激素，尤其是在跃变型的果实中必不可少，关于乙烯在果实成熟软化中的作用及相关基因也报道颇多。促使果实软化的主要原因是细胞壁结构发生变化，细胞结构主要依靠细胞壁的支持，细胞壁中的组分发生了分解导致细胞间的结构改变，导致果实软化。细胞壁组分的变化受细胞壁内的水解酶调控，细胞壁的降解过程有多种酶的参与，例如纤维素酶（Cx）、多聚半乳糖醛酸酶（PG）、果胶酯酶（PME）、β-半乳糖苷酶（β-Gal）、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-Af）等，而这些酶的活性主要是受到基因的控制。

近年来，关于果实软化，研究细胞壁解体、细胞壁相关酶活性及编码这些酶的基因成为了主流。本文将与果实软化有关的细胞壁相关酶基因的研究进展进行综述，以期为探索果实软化机理提供理论依据。

1 果实软化相关酶降解基因研究进展

1.1 果胶酯酶（PME）相关基因

PME是一种催化半乳糖醛残基中C6羧基族脱甲基的酶，在决定果胶含量中起重要作用。在枣果实中PME基因在脆熟期表达出现了，但到软化期反而逐渐减少，这说明PME基因具有果实软化的先导作用。有实验表明PME的活性是由多个PME基因共同调控表达的，在不同品种的蓝莓果实中，不同基因不仅品种间差异较大，而且在不同的发育阶段也各不相同，其中调控最为明显的是PE、PE31、PME3这三个基因。有研究者从杏果实中克隆出一条命名为PaPME1的PME的同源基因，其表达量会受1-MCP和水杨酸的抑制。研究证明桃基因组含有71个PME和30个PMEI基因，它们在8条染色体上分布不均。将71个PME分为36个1型和35个2型PME，这两类PME基因均在脱甲基酯化反应中发挥作用。在鉴定的30个PMEI基因中，有15个在果实成熟过程中表达于两种类型的果实中；5个PMEI基因在MF型桃中表达高于SH型桃，表明这些基因与果实成熟有关。1型PMEs的前区可能参与了活性的自抑制，防止在含有果胶的分泌囊泡中运输期间过早的去酯化。由于2型PMEs缺乏PMEI样的前区，因此在果实成熟过程中，5种PMEI可能共同表达，以阻断分泌囊泡内的活性。通过对两种不同质地桃果实成熟过程中PME和PMEI基因表达谱的分析，研究了3个PMEE和5个PMEI基因的上游调控顺式元件与激素反应的关系。一个PME（Prupe.7G192800）和两个PMEI（Prupe.1G114500 和 Prupe.2G279800）及其启动子被认为是今后研究果实成熟的生化代谢和调控的潜在靶点。不同的品种基因表达的情况也不同，在桃果实中，PME基因‘沙红’在贮藏期间其表达量持续增加，特别是贮藏末期，其表达量到达了采摘当天的7 000倍，但在‘秦王’的整个贮藏期间PME表达量都极低。本实验还证实了乙烯的缺乏会导致PME、PG基因表达受阻，这两种基因在桃果实软化中协同发挥作用，且作用于软化后期。除此之外，草莓果实中也被证明在成熟期PME非常丰富。Cristina Castillejo等人分离出4种不同的草莓PE cDNA，称为FaPE1至FaPE4。FaPE1在果实中有特异表达，在果实成熟过程中表达量增加，在果实的转折期达到最大值。在激素调控方面，生长素处理提高了青果中FaPE1的mRNA水平，而外源乙烯处理降低了成熟和衰老果实中FaPE1的mRNA水平。FaPE1表达的抑制可能与果实衰老过程中的结构变化有关。但也有报道称在苹果软化过程中PME家族中没有一个候选基因受到调控，也没有明显的任何去甲基化。

1.2 纤维素酶（Cx）相关基因

Cx的主要功能是分解含1，4-葡萄糖基链的半纤维素基质多糖。在枣果实中有2个纤维素合成酶基因在果实成熟前期大量表达，与纤维素的含量呈负相关，并证明了枣果实软化使纤维素酶各个基因联合调控的结果。在覆盆子核果软化过程中纤维素酶活性显著提高，在成熟的鳄梨、草莓、黑莓、桃子等果实中也发现了类似的变化。成熟树莓核果中的纤维素酶水平只有鳄梨的0～3%。尽管存在这些相关性，但纤维素酶在果实软化过程中壁破裂的确切作用尚不清楚。在葡萄柚贮藏的中和后期，Cx的活性上升较快，而且基因的表达量也明显增加。有研究者认为，Cx在果实软化过程中可能对PG和PME具有补充的作用。研究者从草莓果实中分离并鉴定出2个不同的EGase cDNA克隆cel1和cel2，在草莓果实成熟过程中，单靠Cel1并不是果实软化的主要决定因素。转Cel1基因植株的EGase活性水平可能来自于Cel2或其它具有CMCase活性的细胞壁酶，这些酶的活性没有降低，从而避免了果实硬度和细胞壁组成的任何变化。另外磷酸三钠（TSP）处理对果胶甲酯、聚半乳糖醛酸酶、纤维素酶和β-葡萄糖苷酶活性也有抑制作用，TSP通过调节细胞壁降解酶活性和控制果胶物质，可以延缓枣果实软化。

1.3 多聚半乳糖醛酸酶（PG）相关基因

最为常见的一种参与果实软化的水解酶就是PG，植物中的PGs是一个非常庞大的基因家族。PG的主要作用就是半乳糖苷键发生水解，令细胞壁结构发生解体，从而使果实软化。PG基因在不同的植物、不同的时期及不同的组织中表达的模式差异比较大，不同时空的表达由各基因家族成员分别调节。姜妮娜等从柿果实中克隆到PG基因的3个全长cDNA，分别命名为DkPG1-3，结果表明，柿果实中DkPG1基因的表达受乙烯调控，参与PG酶合成，从而调控柿果实的成熟衰老。后有研究者从杏果实中克隆出一条命名为PaPG1的PG基因（PaPG基因是杏果实软化最明显的候选基因）并证明了此基因的表达量和PaPME1同样会受1-MCP和水杨酸抑制，因此，PG基因并非果实软化的唯一因素。苹果“长富2”果实在冷藏期间PG的活性以及MdPG1-3基因的表达量都增加了，因此成熟阶段多聚半乳糖醛酸酶的活性是由MdPG1、MdPG2、MdPG3共同调控的。有实验者证明在枣果实中PG基因并非果实软化的关键因子。有实验表明MPG1和MPG2与桃果实的衰老软化均有关系。但也有实验表明仅仅是PG基因不足以引起果实软化，PG并非唯一引起细胞壁降解的因素。研究表明，UV-C辐射延缓了贮藏草莓成熟过程中的软化，UV-C辐射处理后的1小时内，草莓软化的延迟可能是通过降低一组与细胞壁解体有关的FaPG1基因的表达来实现的。因此UV-C处理可以延缓果实的成熟，并保持果实的采后硬度，降低了果实的软化程度。有研究者控制反义PG基因的剂量，增加反义RNA的表达，并使用反义RNA来增强破坏基因表达的能力。功能性PG活性在正常缺陷和含rin突变的水果中的表达，即使在rin的情况下，可溶性果胶增加，也不会引起软化。有研究者在猕猴桃分离到了13个新的PG基因，并证明了AdPG1的启动子与AdBPC2和AdBPC3存在结合和调控效应。另外，在蓝莓果实中，不同品种和部位的PG基因的表达情况有所差异，PG（3）在‘奥尼尔’和‘灿烂’两品种中的表达变化与酶活性时相似的，而PG(1)-(2)基因表达与酶的变化也有一定关系，这表明了酶活性的变化主要受到PG（3）基因的表达的影响，而PG(1)-(2)基因的表达在一定程度上与酶活性的变化也有关系。

1.4 β-半乳糖苷酶（β-Gal）相关基因

β-Gal能从β-半乳聚糖支链非还原末端切除β-半乳糖残基，不但可以降解纤维素和果胶，而且可以降解蛋白和糖脂，令细胞壁的某些组分变得不稳定，从而使细胞壁膨胀，进而使果实发生软化。研究者以苹果果实“长富2”为试材证明了β-Gal的作用时期主要是果实成熟后期，MdGAL1、MdGAL2是重要的编码基因，并且这两种基因的表达是先于β-Gal活性到达高峰的，这说明酶活性的增加可能是由于基因的表达量的增加。Md-gal表达量随着苹果果实发育其基因表达水平显著升高，且在品种间有显著差异。另有研究者表明MdbGAL1、Mdb-GAL2和Mda-AF2是苹果果实软化的重要遗传标记，在今后的转基因和QTL研究中应予以考虑，以更好地了解苹果果实软化，尤其是Mdb-GAL2。周厚成等人从草莓果实中分离出了1个 β-Gal基因家族中的 FaTβgal基因，随着果实成熟，此基因的表达量软质品种‘丰香’和硬质品种‘甜查理’中均快速增加；在果实完全成熟后，此基因在‘甜查理’中的表达量迅速下降到较低水平，而在‘丰香’中仍保持较高水平，这一结论证明了此基因与草莓果实软化密切相关。目前有研究者从猕猴桃中克隆到两个新的 β-Gal基因，分别命名为 AdβGal1和AdβGal2。初期开始，这两个基因均从通过上调基因表达量来参与猕猴桃果实软化，以此来提高β-Gal的活性，从而参与果实软化进程。在桃和香蕉果实中也被证明β-Gal是果实软化所必需的基因。蓝莓果实不同的发育时期，β-Gal16的表达量均在成熟期较高，这时β-Gal的酶活性也较高，这一结果表明β-Gal16基因的表达会影响酶的活性。

1.5 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-Af）相关基因

α-L-Af属于水解酶家族，可以从含有阿拉伯糖残基的非还原末端水解成为一个L-阿拉伯糖分子。有研究者从日本梨（Pyrus pyrifolia）果实中分离纯化了α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-arafase），并分离到一个相关的cDNA克隆（PpARF2）根据该酶的表达模式和性质，它是从果实中分离得到的糖苷水解酶家族3的新成员，可能与果实软化过程中细胞壁结构的改变有关。另有实验证明，在梨成熟过程中，β-Gal和α-L-Af酶活性的提高及其相关基因的表达表明，它们在与果实成熟相关的细胞壁中起修饰作用，因此β-Gal和α-L-Af可能是梨果实软化的必要条件。α-L-Af是香蕉果实成熟的特异诱导因子，在果实软化过程中起重要作用。另外，a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（LeARF1）的基因受到乙烯的负调控，乙烯可以控制其在成熟过程中的表达下降和mRNA翻译或激活α-L-Af原蛋白。实验证明α-L-Af的基因表达量与果实硬度呈负相关，并且用1-MCP处理能明显抑制贮藏中后期α-L-Af基因的表达量，尤其是贮藏后期抑制效果尤为明显。也有实验表明果实采后使用外源钙处理可以降低α-L-Af的活性和其基因表达。

2 存在问题及发展前景

果实软化是果实衰老的一个重要特征，果实软化主要是因为细胞壁结构的变化，细胞壁相关酶的活性变化会导致细胞壁降解。细胞壁水解酶的活性又会受到基因的调控，其基因的表达量会影响果实软化。这一点在草莓、柿、桃、蓝莓、猕猴桃等果实中已经得到证实。

在果树果实中 PG、PME、Cx、β-Gal和 α-L-Af基因的表达量对酶活性的影响和果实软化的作用都有了一定的研究。但仍存在一些问题，目前大多数的研究仅限于对这些细胞壁相关水解酶基因单独的研究，较少探索它们之间的相互关系及作用等，关于果实软化的细胞壁相关水解酶基因之间可能存在这相互制约或者相互促进的关系；与果实软化相关的细胞壁水解酶的不同基因表达的时间和时期各不相同，同一基因在各个果树果实中的表达时期也不尽相同，尚未见对此有系统性的研究。

未来关于果树果实软化细胞壁相关水解酶基因的研究可以从以下几个方面入手：选择某一种果树果实，探究各相关水解酶基因与果实软化的关系。总结不同成熟度与各个基因表达量的关系；探索新的可抑制各个与果实软化相关基因的表达量的方法，为果实采摘后保鲜及贮藏提供科学依据；研究与果实软化相关酶基因之间的相互关系及作用；测量同一果实不同成熟期的基因表达量和同一基因在不同果实成熟时期的基因表达量等；对关键基因进行克隆，通过合理的实验设计来确定基因的功能，探索更多同源基因家族；可以控制反义RNA的表达，并使用反义RNA来增强破坏基因表达的能力，以此来抑制功能基因的表达来控制果实软化。