猪塞尼卡谷病毒诊断方法的研究进展

林正丹 连凯琪 周玲玲 宋玉伟

（河南省动物疫病防控与营养免疫院士工作站/河南省兽用生物制品研发与应用国际联合实验室/安阳工学院生物与食品工程学院455000）

上个世纪80 年代就报道过美国、新西兰等国家出现一种病因不明的猪水疱病[1]。 其临床症状为病猪鼻部和蹄部出现水泡、溃疡或糜烂，但检测结果却排除了口蹄疫病毒病和猪水疱病。 据报道，2004 年美国一个州的猪群出现了水泡性疾病症状，但当时并未确诊。 直到2007 年美国、加大拿猪群爆发水泡性疾病，最后排除猪水疱病后，确诊为塞尼卡谷病毒（Seneca Valley Virus，SVV） 感染。 自 2015 年美国中部往西大多数地区猪群爆发感染SVV 后，泰国、巴西、哥伦比亚等国家也爆发出该疫情。 2016 年到2017 年我国福建，黑龙江、河南等省猪群陆续发生SVV 感染[2]。 虽然SVV 疫情不像口蹄疫在全球范围传播，但部分地区的猪群大量死亡也给养殖场带来一定的经济损伤，因此尽快确诊疫情，控制其蔓延是首要的。

为了能区分塞尼卡谷病毒病、口蹄疫病毒病和猪水疱病的临床症状，短时间做出判断，尽早采取措施进行预防和控制疫情，往往采用实验室方法进行SVV 确诊。 本文旨在对SVV 的相关诊断方法进行总结。

1 病原学诊断方法

1.1 病毒分离

该方法是将采集病猪剖检组织研磨成悬液，-20℃反复冻融离心过滤除菌接种到敏感离体细胞，再经过一系列操作进行核酸或者SVV 检测鉴定。 2016 年赵晓亚等[3]首次分离鉴定出国内的塞内卡谷病株，收集从2015～2016 年广东省各地区猪场疑似感染SVV 病畜的内脏组织和水泡渗出液、粪便样本进行病毒分离和传代培养后，在显微镜下观察到一些细胞死亡，病变细胞变圆，表面粗糙且折光性增强。 张志等[4]采取无临床症状猪群的内脏组织样本，分离病毒，检测为阳性。 病毒分离方法传代培养能较好的控制单一条件，保证分离出纯种病毒并且能估定滴度，但是耗时耗力。

1.2 电子显微镜观察

Laura M.Hales 等[5]用直接涂敷法将纯化的SVV 在涂有碳涂层的聚醋酸甲基乙烯脂网格上，用醋酸铀酰水溶液对细胞进行整块染色，乙醇脱水，渗透并包埋在塑料树脂中； 用金刚石切60～80nm 的超薄切片，安装在铜网格上； 然后用乙酸铀酰和柠檬酸雷诺兹铅对网格进行染色，并使用透射电镜放大25 万～61 万倍进行检测。 使用电子显微镜观察SVV 虽然结果直观，但制作过程复杂且需要昂贵的仪器，耗费人力物力。

2 免疫学诊断方法

2.1 病毒中和试验

用终点稀释法测定SVV 血清中抗体的中和活性，将血清灭活后连续稀释2 倍，与等体积100TCID50 的SVV 混合，37℃温育1h，加入NCI-H1299 细胞培养72h 后观察细胞病变情况，并测定细胞病变为90%～100%被抑制时为中和抗体效价[6]。

2.2 竞争ELISA

Ming Yang 等[6]采用二乙胺灭活SVV 抗原免疫小鼠制备单克隆抗体，建立了SVV 竞争性酶联免疫吸附 （cELISA） 实验，并且与间接ELISA 和病毒中和试验结果进行比较。 Melissa Goolia 等[7]首先验证了以前开发的 cELISA，充分证明出cELISA 可做检测不同物种SVV 抗体的手段。 之后又将cELISA与病毒中和试验和免疫荧光抗体检测进行对比，相比之下，cELISA 很容易实施，适合猪场的大规模检测，并且成本便宜。

3 核酸检测方法

3.1 反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）

逆转录聚合酶链式反应 （RT-PCR） 首先将RNA 转录DNA中，再经过PCR 反应检测细胞中RNA 病毒的含量。 范慧等[8]根据3D 基因设计引物，建立了诊断SVV 的RT-PCR 检测手段。 刘涛等[9]基于口蹄疫的5’ -UTR 基因以及塞尼卡谷的VP1 基因设计引物，建立了口蹄疫病毒和塞尼卡谷病毒的RTPCR 鉴别诊断方法。 RT-PCR 诊断方法敏感度高，特异性好，效率高且方便快捷，操作简单，易于掌握。

3.2 实时荧光RT-PCR（qRT-PCR）

此方法基于RT-PCR，在PCR 过程中将荧光基团与cDNA混合，经过荧光信号的积累实时监测整个PCR 过程。 最终，采用合适的数据分析法定量分析初始数据模板。 樊晓旭等[10]基于3D 基因区域设计和筛选出一组最佳引物和探针，建立了TaqMan 实时荧光PCR 检测方法，得出qRT-PCR 敏感度和效率远高于RT-PCR 的结论。 qRT-PCR 能迅速稳定的检测出SVV，而且污染少，操作简便，能实时监控。

3.3 反转录液滴数字PCR（RT-ddPCR）

反转录液滴数字聚合酶链式反应是最近几年兴起的病毒检测技术。 Zhou[11]等选择高度保守区域3D 基因设计了RT-ddPCR 引物和TaqMan 探针，建立了一种依赖线性曲线，只通过泊松分布公式计算直观结果的SVV 检测方法。 该检测方法灵敏度比实时PCR 高，准确度和重复性也很好，而且成本较低，能实现绝对定量分析。

4 重组酶聚合酶等温扩增技术

重组酶聚合酶等温扩增是在常温条件下进行核酸扩增。Piepenburg 等[12]将RPA 与实时荧光检测方法和测流层析试纸条相结合建立了两种检测RPA 产物的方法。

4.1 重组酶聚合酶扩增-实时荧光（real-time-RPA） 检测方法

樊晓旭[13]等针对3D 基因设计和筛选出合适的引物进行荧光定量PCR 反应，建立了一种高效的SVV real-time-RPA 检测方法。 该方法结合重组酶聚合酶等温扩增和实时荧光反应，不仅能实时监控反应过程，而且方便快捷，节约成本和能量，也能在实验室外操作。

4.2 重组酶聚合酶扩增-测流层析试纸条（RPA-LFD） 检测方法

樊晓旭[14]等对比3D 基因序列设计了引物和探针，建立起结合重组酶聚合酶扩增结合流动色谱条 （RPA-LFD） 的SVV检测方法。 该方法不依赖任何设备，对感染SVV 的猪群能快速诊断，为控制病情、进行治疗提供很大帮助。

5 结语

综上所述，SVV 的危害虽然没有口蹄疫病毒病大，但由于其分子结构和引发的临床特征相似，也给养殖场和技术人员带来一定的麻烦和经济损失。 特别是最近几年越来越多有关SVV疫情的报道，引起高度重视。 但到目前为止仍未开发出可用的疫苗，为了有效控制疫情的扩散和传播，急需建立准确度高且方便快捷的诊断方法。 本文对SVV 的分子结构和临床特征进行简略介绍，并总结SVV 的诊断方法，为后续研究、预防和治疗SVV 病提供参考。