黄花蒿挥发油对赤拟谷盗成虫和幼虫的生物活性研究

程 昉 邵亚洲 杨盈盈 刘芯莹 王婧婧 贾凌云 梁俊玉

(西北师范大学生命科学学院，兰州 730070)

赤拟谷盗Triboliumcastaneum属鞘翅目拟步甲科，又称拟谷盗，是一种遍及全世界的重要储粮害虫，涉及谷物、油料、中药材及动物性产品等。它食性广，寿命长，适应性强，繁殖迅速[1,2]。赤拟谷盗主要为害面粉，其有臭腺分泌臭液，使小麦粉等发生霉腥味(主要使小麦粉水分上升，黏度、蛋白含量下降)，分泌物还包含致癌物苯醌[3]。幼虫蛀食贮存期的烟叶和茶叶，且导致霉变，也可蛀入粮粒等贮藏物内取食，造成严重的经济损失[4]。

长期、过量使用化学杀虫剂容易造成害虫对此类杀虫剂产生严重的抗性。同时多种化学杀虫剂在使用过程中有残留，并通过食物链和生物富集作用进入人体，危害人类健康[5]。植物源杀虫剂，直接利用或提取植物的根、茎、叶、花、果、种子等或利用其次生代谢物质制成具有杀虫作用的活性物质[6,7]。相比之下，植物源杀虫剂绿色环保，且用量低、易降解，对哺乳动物危害小，可作为防治仓储害虫的措施之一[8,9]。近年来，植物源杀虫剂的研究和开发受到越来越多的重视，天然植物精油对部分昆虫和仓储害虫具有驱避和熏杀作用，可以作为安全低毒的天然驱避剂和熏杀剂[10-12]。

黄花蒿Artemisiaannua是菊科蒿属植物，分布于中国全境，以及欧洲、亚洲的温带、寒带和亚热带地区，生境适应性强[13-15]。目前国内外对黄花蒿的研究涉及抗疟有效成分—青蒿素[16-18]、黄花蒿的抑菌和抗氧化活性[19,20]以及黄花蒿挥发油的成分分析及活性测试等。黄花蒿挥发油主要利用水蒸气蒸馏法提取，并采用气相色谱-质谱联用仪分析其化学成分[21]，而黄花蒿挥发油主要是对植物害虫(菜蚜等)进行生物活性测试[22-23]。本实验研究了黄花蒿挥发油的化学成分及其对赤拟谷盗成虫和幼虫的触杀和驱避活性，为蒿属植物挥发油防治粮食仓储害虫提供参考。

1 材料与方法

1.1 植物材料和挥发油提取

黄花蒿于2017年8月采自甘肃省兰州市安宁区(海拔1 503 m，东经102° 35′ 58″E，北纬35° 34′ 20″N)。将黄花蒿的新鲜叶片切碎，取500 g放入挥发油提取器中进行提取6 h。油水经正己烷(分析纯)溶剂萃取，无水硫酸钠脱水处理后过滤，减压浓缩至不含溶剂，得到无色挥发油4.5 mL。将挥发油放至密封容器中并于4 ℃冰箱中保存。

1.2 试虫饲养

将赤拟谷盗饲养在小麦粉和酵母粉比例为10∶1，容积为0.5 L的玻璃瓶中，温度为(29±1)℃，相对湿度为70%～80%。待其羽化为成虫1～2周后，取出进行活性实验。对于幼虫，选择6日龄幼虫进行活性研究。

1.3 挥发油的GC-MS分析

本实验采用安捷伦6890 N气相色谱(FID检测器)和安捷伦5973 N型质谱联用分析挥发油的化学组分。实验中采用的色谱柱为HP-5MS型(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，升温程序为60 ℃开始并保持2 min，然后以10 ℃/min速度升到180 ℃并保持1 min，再以20 ℃/min速度升到280 ℃并保持15 min；1 μL样品(用正己烷稀释到1%)被注射到气相色谱仪中，分流比为1∶10；载气为氦气，流速为1.0mL/min。通过与NIST数据库对比来鉴定挥发油中每种组分，其相对百分含量通过面积归一法获得[24]。

1.4 触杀活性

根据参考文献[25,26]的方法测定黄花蒿挥发油对赤拟谷盗的触杀活性。将成虫或幼虫放在培养皿中置于冰袋上，然后用移液枪取0.5 μL样品的正己烷稀释液滴于停止行动的试虫前胸背板上(幼虫直接滴于其背上)，处理后放入直径2.5 cm，高5.5 cm的玻璃瓶中。正己烷为空白对照组，除虫菊素(纯度27%，质量分数分别为0.2%、0.1%、0.05%、0.025%、0.012 5%)和阿维菌素(纯度99.2%，质量分数分别为15%、3%、0.6%、0.12%、0.024%)分别作为成虫和幼虫的阳性对照组，各样品设置5个质量分数梯度(成虫：5.2%、7.9%、11.8%、17.9%、26%、40%；幼虫：5.9%、8.88%、13.3%、20%、30%)，每个质量分数重复5次，每次重复试虫10头。处理后置于温度(29±1)℃，相对湿度为70%～80%的恒温培养箱中暗培养24 h，观察记录死亡情况，并计算死亡率与校正死亡率。采用 SPSS22.0统计软件分析计算半致死剂量LD50(μg/头)。

死亡率=(死虫数/试虫数)×100%

校正死亡率=[(处理组死亡率-对照组死亡率)/(1-对照组死亡率)]×100%

1.5 驱避实验

根据参考文献[27,28]方法测定黄花蒿挥发油对赤拟谷盗的驱避活性。用正己烷溶解挥发油，将黄花蒿挥发油制成5个连续浓度(0.5%、0.1%、0.02%、0.004%、0.000 8%)梯度的溶液。取与培养皿(直径9 cm，高1.9 cm)底相同直径的滤纸，沿中线对半剪开，一半滴加500 μL稀释溶液，另一半滴加等量正己烷做为空白对照。等溶剂自然挥发后，立即用固体胶将处理过的滤纸相向紧贴在培养皿底部，注意粘牢不留缝隙，以防止试虫钻到滤纸下面，影响观察。将20头试虫从培养皿中央投入，迅速盖上培养皿盖子并密封。不同浓度的样品同法处理5个平行样。同时以避蚊胺(DEET，纯度99%，浓度分别为78.63、15.73、3.15、0.63、0.13 nL/cm2)作为阳性对照。在2、4 h后观察统计出现在不同区域内的试虫数量，计算驱避率。

驱避率(PR)用下列方程式计算：

PR=[(Nc-Nt)/(Nc+Nt)]×100%

其中，Nc为出现在阴性对照区域的试虫数量，Nt为出现在实验组区域的试虫数量，计算出PR的平均值。

1.6 数据分析

校正死亡率的数据利用Abbott公式计算出。采用SPSS V22.0统计软件分析计算触杀的半数致死量。在驱避实验中，斜率和标准误的值由 Excel 2007软件计算得出。

2 结果与分析

2.1 黄花蒿挥发油的化学组分

从黄花蒿挥发油中鉴定出31种化合物，其主要组分为蒿酮13.2%，β-芹子烯12.3%，樟脑12.2%，桉叶油醇10.3%，结果见表1。

表1 黄花蒿挥发油化学组分及其相对含量

续表

据报道，江西永修野生黄花蒿花挥发油的得率为0.98%，其化学成分主要为桉油精(18.86%)、樟脑(16.55%)、α-愈创木烯(6.82%)、大根香叶烯(6.74%)、石竹烯(5.97%)、顺式-乙酸菊花烯酯(5.45%)[29]。河南省黄花蒿采于8月，其挥发油得率为0.46%，主要成分为蒿酮(46.654%)、桉油精(13.422%)、樟脑(9.648%)[30]。在智亚楠的研究中黄花蒿采于8月，与本实验样品几乎同期，但是其得率远低于本实验黄花蒿。因此推测，黄花蒿挥发油含量与其生长环境密切相关。河南省黄花蒿挥发油与本实验的黄花蒿挥发油的主要成分大致相同，但成分的含量有明显的差异。江西永修野生黄花蒿挥发油与本实验的黄花蒿挥发油的主要成分相差较大。由此可见，不同产地黄花蒿挥发油主要成分及含量均有一定的差异，说明地域因素对黄花蒿挥发油化学成分有较大的影响。

2.2 触杀活性

黄花蒿挥发油对赤拟谷盗成虫和幼虫的触杀活性的结果见表2。由表2可知，黄花蒿挥发油对赤拟谷盗成虫和幼虫的LD50分别为37.32 μg/头和70.34 μg/头。与阳性对照相比，黄花蒿挥发油对赤拟谷盗成虫的LD50是除虫菊素的149.53倍，对赤拟谷盗幼虫的LD50是阿维菌素的12.33倍。黄花蒿挥发油对赤拟谷盗成虫的LD50明显小于对幼虫的LD50，因此，黄花蒿挥发油对赤拟谷盗成虫的触杀效果较幼虫的强。

表2 黄花蒿挥发油对赤拟谷盗成虫和幼虫的触杀活性

研究表明，赤拟谷盗幼虫对挥发油触杀作用的敏感性随日龄的增加而增加：12日龄的赤拟谷盗幼虫对挥发油毒性的敏感性要弱于成虫，但是，14～16日龄的赤拟谷盗幼虫对挥发油毒性具有与成虫相同的敏感性[31]。这与本实验所得的结论相符：黄花蒿挥发油对赤拟谷盗幼虫的触杀效果较成虫的弱。与其他基于相同作用方法的植物源挥发油的生物活性测试相比，黄花蒿挥发油对赤拟谷盗成虫的触杀作用较强。如鞠克升[32]的研究发现，珠光香青挥发油对赤拟谷盗成虫的触杀LD50为41.25 mg/头；吴彦等[33]的研究发现，侧柏叶挥发油对赤拟谷盗成虫触杀的LD50为48.59 μg/头。本实验发现赤拟谷盗幼虫对黄花蒿挥发油的敏感性较成虫弱，这与韩群鑫等[34]的研究发现赤拟谷盗对丁香酚幼虫比成虫更敏感有所不同。

2.3 驱避活性

黄花蒿挥发油对赤拟谷盗成虫和幼虫的驱避作用见图1、图2。由图1、图2可见，黄花蒿挥发油对赤拟谷盗成虫具有一定的驱避活性。黄花蒿挥发油对赤拟谷盗成虫在高剂量(78.63、15.73 nL/cm2)下作用2 h和4 h后的驱避效果与避蚊胺相似，在0.63 nL/cm2下的驱避效果均弱于避蚊胺，在0.13 nL/cm2下作用2 h的效果反而强于避蚊胺。在作用2 h后，在5个测试浓度下，黄花蒿挥发油对赤拟谷盗幼虫的驱避活性低于避蚊胺活性，作用4 h后，在高剂量(78.63、15.73 nL/cm2)下黄花蒿挥发油对赤拟谷盗幼虫的驱避活性高于避蚊胺活性；而在3.15 nL/cm2下，黄花蒿挥发油对赤拟谷盗幼虫的驱避活性低于避蚊胺活性。这个结果表明，黄花蒿挥发油与阳性对照避蚊胺对赤拟谷盗幼虫具有相近的驱避作用。由此可见，黄花蒿挥发油对赤拟谷盗成虫的驱避作用比对幼虫的驱避作用强。

3 结论

本实验通过 GC/MS 分析了黄花蒿挥发油成分及含量，并通过生物活性筛选发现黄花蒿挥发油对赤拟谷盗成虫和幼虫均具有良好的触杀活性和驱避作用。

虽然黄花蒿挥发油的作用效果均弱于或相似于阳性对照，但作为粮食仓储害虫防治剂，具有对有害生物高效、对非靶标生物安全、易分解、绿色无污染等特点，且提取方法简单，出油率高，资源丰富，在害虫防治中可作为较理想的化学农药替代品之一。另外，关于黄花蒿挥发油对赤拟谷盗卵的生物活性，对成虫产卵行为的干扰作用，对害虫种群的抑制作用以及对赤拟谷盗成虫和幼虫的作用机理仍需要进一步深入研究，进而从根本上解决粮食仓储害虫防治的问题。