Box-Behnken响应面优化大豆7S球蛋白含促溶剂的反胶束提取工艺

孙 雪 赵晓燕 张晓伟 刘红开 朱运平

(济南大学烹饪学院食品科学与营养系1, 济南 250022) (北京工商大学北京市食品添加剂工程技术研究中心2, 北京 102488)

大豆分离蛋白富含多种人体所需的必需氨基酸[1]，与鸡蛋白同属于优质蛋白，因此在食品加工领域应用广泛[2]。大豆分离蛋白作为植物中优质蛋白的代表,不仅营养价值高，而且具有良好的功能特性[3]。大豆分离蛋白根据沉降系数可分为2S、7S、11S和15S球蛋白[4]，其中7S球蛋白的含量约占总大豆分离蛋白的30%左右[5]，所以7S球蛋白与大豆分离蛋白的功能特性有密不可分的关系。

反胶束提取法作为一种新兴的蛋白萃取方法[6]，与传统的碱提酸沉法和等电点沉淀法想比，所提取的蛋白具有良好的功能特性及稳定的空间结构[7]，因此具有广阔的发展前景。目前，反胶束已经成为最有吸引力和前景的蛋白质提取方法之一[8]，但反胶束体系提取的蛋白存在提取率低、成本高等缺点，因此难以应用到实际的工业生产[9]。

反胶束提取蛋白的过程包括前萃取和后萃取这两个过程。在以往反胶束萃取蛋白的研究中，对促溶剂的研究较少。目前，主要有关于反萃取添加促溶剂的研究，常用的反萃取促溶剂有尿素和盐酸胍等[10]，但尿素和盐酸胍属于蛋白常用的变性剂，因此会对蛋白质天然结构造成一定的破坏。另外，反萃取的提取率通常要远远高于前萃取率，因此提高前萃取率是提高反胶束最终提取率的关键。蔗糖属于天然可提取的二糖，而三氯蔗糖是其氯化衍生物。尽管蔗糖和三氯蔗糖具有相似的化学结构，但是它们对蛋白质的作用却有很大差异[11]。蔗糖可以稳定蛋白质的天然结构，而三氯蔗糖则会破坏蛋白质的天然结构[12]。此外，蔗糖和三氯蔗糖是大量水和动力学的有效还原剂[12]。这为提高反胶束的萃取率提供了思路。

在本研究中选取了蔗糖和三氯蔗糖作为促溶剂，通过单因素试验，结合Box-Behnken响应面进行优化试验设计，研究了不同种类和浓度的促溶剂对反胶束萃取7S球蛋白萃取率的影响。本研究将会有助于进一步提高反胶束萃取蛋白的提取率，对反胶束技术实现工业化生产具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

该大豆是由山东省农科院作物研究所提供的非转基因大豆新品种(齐黄34)，蛋白质质量分数为42.77%，脂肪为21.26%。大豆经粉碎机粉碎后，过100目筛，再经正己烷脱脂后获得脱脂大豆粉。

比辛可宁酸(BCA)蛋白测定试剂盒、双(2-乙基己基)磺基琥珀酸钠(AOT)、正己烷、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、亚硫酸氢钠、氢氧化钠、盐酸、浓硫酸、乙醇、冰醋酸、十二烷基磺酸钠(SDS)、甘氨酸、2-巯基乙醇(2-Me)、考马斯亮蓝。

1.2 仪器与设备

TGL16M台式高速冷冻离心机，FD-1A-50冷冻干燥机，OSI-SDL恒温水浴震荡器，UPT-I-10T超纯水机，UV756紫外可见光分光光度计，ZSD-2自动水分滴定仪，AE-6500电泳仪，6202小型高速研磨机，pH酸度计，KQ3200DB型数控超声波清洗器。

1.3 方法

1.3.1 等电点沉淀法提取大豆7S球蛋白

参照NAGANO[13]等方法提取大豆7S球蛋白，略有改动。称取12 g的脱脂大豆粉放入三角锥形瓶中，加入500 mL(pH 8.0)超纯水，在45 ℃恒温水浴中，250 r/min以上的速度震荡2 h，然后在8 000r/min的条件下离心20 min，取上清液。上清液中添加NaHSO3，使浓度为0.01 mol/L，然后用2 mol/L的HCl调pH至6.4，4 ℃下贮藏过夜，然后离心(12 000×g，20 min，4 ℃)。所得上清液加NaCl调离子浓度至0.08 mol/L，用2 mol/L的HCL调pH至5.4，离心(9 000×g，30 min，4 ℃)，上清液加入等体积冰水，用2 mol/L的HCl调pH至4.8，离心(12 000×g，20 min，4 ℃)。沉淀水洗2次后用超纯水溶解，调pH至7.5，4 ℃下透析24 h，冷冻干燥后得大豆7S球蛋白。

1.3.2 反胶束萃取法提取大豆7S球蛋白

参照ZHAO[14]等方法，略有改动。称取一定质量的AOT于锥形瓶中，加入一定体积的正己烷，配制成0.08 g/mL的溶液，使表面活性剂完全溶解，取20 mL的AOT反胶束体系进行试验，加入浓度为0.05 mol/L的电解质缓冲溶液，超声15 min后静置澄清，溶液透明后加入等电点沉淀法提取的大豆7S球蛋白粉，在恒温水浴中，250 r/min的速度震荡，然后在4 800 r/min的条件下离心15 min，取上层前萃液，采用BCA蛋白浓度测定法[15]检测前萃液中蛋白质含量，计算蛋白前萃率。

前萃液加入等体积的电解质(KCl)缓冲液(KH2PO4-Na2HPO4)，在恒温水浴中，250 r/min的速度震荡，然后在4 800 r/min的条件下离心15 min，取下层后萃液，采用BCA蛋白浓度测定法[15]检测后萃液中蛋白质含量，计算蛋白后萃率。后萃液在4 ℃下透析24 h，冷冻干燥得纯化后的7S球蛋白。

1.3.3 反胶束提取7S球蛋白的前萃和后萃单因素试验设计

前萃试验中选取蔗糖和三氯蔗糖及其浓度(0～2 mol/L)、W0(0～30)、缓冲液pH (2～13)、电解质浓度(0～0.4 mol/L)、萃取温度(30～60 ℃)、萃取时间(10～60 min)、固液比为(0.5～5 g/L)作为前萃取单因素用于进一步试验。

在后萃试验中选取电解质浓度(0～1.6mol/L)、缓冲液pH(3～13)、萃取温度(30～60 ℃)及萃取时间(10～60 min)作为反萃取单因素用于进一步试验。

1.3.4 反胶束提取大豆7S球蛋白的响应面试验设计

在前萃单因素试验基础上，前萃选择蔗糖浓度(A)、电解质浓度(B)、pH(C)三个因素，以大豆7S球蛋白前萃率(Y)为指标；在后萃单因素试验基础上，后萃选择电解质浓度(A)、pH(B)、后萃温度(C)三个因素，以大豆7S球蛋白后萃率(Y)为指标，采用Box-Behnken设计进行试验，以-1、0、1编码自变量低、中、高水平，因素水平编码见表1与表2。

表1 前萃Box-Behnken试验设计

表2 后萃Box-Behnken试验设计

1.4 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(SDS-PAGE)

将蛋白粉末溶于超纯水中配制成质量浓度为2 mg/mL的蛋白溶液，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳具体操作参照文献[16]。

2 结果与分析

2.1 促溶剂的种类和含量对大豆7S蛋白前萃提取率的影响

图1显示了蔗糖和三氯蔗糖浓度对反胶束正向提取速率的影响。如图1所示，添加蔗糖和三氯蔗糖的反胶束前萃率可以分别从37.19%提高到78.82%和69.90%。这表明促溶剂的添加可以显著提高反胶束体系提取7S球蛋白的前萃率，并且蔗糖的促进效果较三氯蔗糖更好。

蔗糖和三氯蔗糖对大豆7S球蛋白前萃率的促进作用，可能是因为添加的蔗糖和三氯蔗糖分子存在于反胶束的水池以及界面区域，较大尺寸的蔗糖和三氯蔗糖分子从反胶束的界面置换了较小的水分子，并在界面区域与AOT的磺酸盐基团形成了更强的分子间氢键，导致反胶束的水池尺寸增大[17]。此外，蔗糖分子与水之间的氢键相互作用比水分子本身之间的氢键相互作用更强，导致反胶束整体的微黏度增加[18]，增加了蛋白质的溶解度。对于三氯蔗糖，由于三氯蔗糖中存在较少的-OH基团(因为此处三个-OH基团被相对较大尺寸的氯原子取代)，疏水性或氢键键合效率的程度较小，这可能也是导致三氯蔗糖的促进效果低于蔗糖的一个原因[19,20]。蔗糖作为一种天然的甜味剂[21]，与三氯蔗糖相比不仅更加安全而且价格更加廉价，并且加入少量的蔗糖就可以达到显著提高萃取率的效果，这为反胶束技术实现工业化生产提供了理论依据。

图1 不同浓度蔗糖和三氯蔗糖对反胶束提取7S球蛋白提取率的影响

2.2 响应面结果与分析

2.2.1 反胶束萃取大豆7S球蛋白的前萃响应面试验结果与分析

如表3所示，Box-Behnken试验进行了17次运行，以优化三个单独的提取参数。采用响应面软件Design Expert 10.0对表3试验数据进行多元回归拟合，得到的分析结果见表4。经回归拟合后，建立多元二次响应面回归模型：Y=72.43-1.71A+1.63B+1.65C+0.58AB-2.06AC+0.26BC+2.00A2+2.90B2-2.76C2

由表4可知，R2=0.981 4，模型P<0.001，说明模型具有极显著性。且失拟项P>0.05，失拟项不显著，说明二次多项回归方程拟合程度良好，具有统计学意义。

F值与响应值的影响成正比，F值越大对响应值的影响越大[22]，因此，各因素对7S球蛋白前萃提取率的影响排序依次为蔗糖浓度>pH>电解质浓度，且蔗糖浓度该因素的P<0.05，这也证明与其他影响蛋白前萃率的因素相比，蔗糖浓度对蛋白前萃率影响最为显著。由表4各交互因素的F值和P值大小可以发现，蔗糖浓度与电解质浓度(AB)的F值较小，且P>0.05，表明交互作用对7S球蛋白前萃提取率的影响较小；蔗糖浓度和pH(AC)F值较大，且P<0.05，说明其交互作用对7S球蛋白前萃提取率的影响显著；电解质浓度与pH(BC)的P>0.05，但F值较AB交互作用更大，说明BC交互作用对7S球蛋白前萃提取率的影响较AB更大。

表3 前萃响应面试验设计和结果

表4 回归方程的方差分析表

通过Design-Expert软件响应面进行分析，得到以下最佳前萃条件：蔗糖浓度0.04 mol/L、电解质浓度0.2 mol/L、pH为8.719。在最佳条件下，7S球蛋白最大预测前萃率为83.301%。考虑到萃取过程的实际操作，优化条件为：蔗糖浓度0.04 mol/L、电解质浓度0.2 mol/L、pH为8.7，在此条件下进行3次平行验证试验。结果表明，实际试验前萃率为83.21%，与预测产量无显著差异，说明此回归模型与实际情况具有良好的拟合性，所建模型准确，可靠且具有实用价值。

对比关于AOT反胶束提取植物蛋白的研究发现：HE[23]等提取的菜豆凝集素，刘远海[24]等提取的大豆蛋白，王宪昌[25]等萃取的核桃粕蛋白的前萃率分别为 53.28%、65.37%和68.7%；本试验提取的大豆7S球蛋白前萃率达到了83.21%，证明促溶剂可以显著提高AOT反胶束体系提取蛋白的前萃率。

2.2.2 反胶束萃取大豆7S球蛋白的后萃响应面结果与分析

如表5所示，Box-Behnken试验进行了17次运行，以优化三个单独的提取参数。采用响应面软件Design Expert 10.0对表5试验数据进行多元回归拟合，得到的分析结果见表6。经回归拟合后，建立多元二次响应面回归模型：

Y=77.03+1.46A+9.06B-0.30C-3.41AB+0.38AC+0.57BC+1.70A2+1.75B2-2.96C2

表5 后萃响应面试验设计和结果

由表6可知，R2=0.993 6，模型P<0.001，说明模型具有极显著性。且失拟项P>0.05，失拟项不显著，说明二次多项回归方程拟合程度良好，具有统计学意义。

表6 回归方程的方差分析表

由F值和P值可知，各因素对后萃率的影响排序依次为pH>电解质浓度>温度。由表6各交互因素的F值、P值的大小可以发现，pH和电解质浓度(AB)相比于其他两种交互作用的F值最大，且P<0.001，说明其交互作用对7S球蛋白后萃提取率的影响极显著；电解质浓度与温度(AC)的F值较小，且P>0.05，表明交互作用对7S球蛋白后萃提取率的影响较小；pH与温度(BC)的P>0.05，但F值较AC交互作用更大，说明BC交互作用对7S球蛋白后萃提取率的影响较AC更大。

通过Design-Expert软件响应面进行分析，得到以下最佳萃取条件：电解质浓度0.8 mol/L、pH为12、温度54.908 ℃。在最佳条件下，7S球蛋白最大预测后萃率为91.499%。考虑到萃取过程的实际操作，优化条件为：电解质浓度0.8 mol/L、pH为12、温度55 ℃，在此条件下进行3次平行验证试验。结果表明，实际试验后萃率为90.5%，与预测产量无显著差异，说明此回归模型与实际情况具有良好的拟合性，所建模型准确，可靠且具有实用价值。

2.3 SDS-PAGE分析

图2显示了等电点沉淀法与反胶束萃取法所制备的大豆7S球蛋白的SDS-PAGE结果。大豆7S球蛋白由α`(58 ku)亚基、α(57 ku)亚基和β(42 ku)三个亚基组成。从电泳条带可以看出两种方法分离的蛋白条带对应的分子量与大豆7S球蛋白组分吻合[26]，因此可以确定两种方法得到的蛋白样品的确是大豆7S球蛋白这一组分。通过图2可以发现等电点沉淀法制备的7S球蛋白α亚基(66.2～45.0 ku之间)存在部分解离现象，条带减弱分解成分子量较小的条带，而反胶束制备的7S球蛋白不存在这一现象。这可能是因为等电点处理的酸碱环境在一定程度上诱导了7S球蛋白的解折叠[27]，从而导致α亚基出现部分解离。而蔗糖具有在不利条件下维持蛋白质正常结构的独特能力[28]，因此含蔗糖的反胶束处理使等电点提取的7S球蛋白的折叠结构得到了恢复。运用Quantity One分析软件对图2电泳图进行纯度分析，结果表明等电点沉淀法提取的大豆7S球蛋白的纯度为92.01%，经反胶束纯化后的大豆7S球蛋白的纯度达到了96.17%。这说明含蔗糖的反胶束不仅可以进一步提高等电点提取的7S球蛋白的纯度，而且还能使蛋白分子的亚基折叠结构得到恢复。

注：M为标准蛋白，1、2分别为等电点7S球蛋白，3、4分别为反胶束7S球蛋白，5、6分别为大豆分离蛋白。图2 大豆7S球蛋白和大豆分离蛋白电泳图

3 结论

本研究选取了蔗糖和三氯蔗糖作为反胶束提取大豆7S球蛋白的促溶剂，研究了不同种类的促溶剂及含量对反胶束萃取大豆7S球蛋白提取率的影响。研究发现，蔗糖较三氯蔗糖的促进效果更好，与未加入促溶剂的反胶束体系相比，加入促溶剂的反胶束体系的前萃率最高增加了35.6%。经过单因素试验与响应面优化实验设计，发现蔗糖浓度较其他提取因素对前萃率的影响最大，这也证明了促溶剂的研究对提高反胶束蛋白萃取率具有重要意义。

反胶束提取大豆7S球蛋白的最佳前萃和后萃条件为：在蔗糖浓度0.04 mol/L、W0为22、pH为8.7、电解质浓度0.2 mol/L、萃取温度55 ℃、萃取时间50 min、固液比为1.5 g/L的条件下，蛋白前萃率为83.21%；在电解质浓度0.8 mol/L、pH为12、萃取温度55 ℃、萃取时间20 min的条件下，蛋白后萃率为90.5%。最终蛋白总萃取率为75.31%。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明，含蔗糖的反胶束不仅可以进一步提高等电点提取的7S球蛋白的纯度，而且还能使蛋白分子的亚基折叠结构得到恢复。