响应面优化水酶法制备“纸皮”扁桃油

田荣荣 牛 童 胡 静 肖勋泽 许新桥 王 伟

(林木遗传育种国家重点实验室；中国林业科学研究院林业研究所1，北京 100091) (北京城市学院生物医药学部2，北京 100094)

扁桃(Prunusdulcis(Mill.) D.A.Webb.)属蔷薇科桃属扁桃亚属植物[1-3]。扁桃是著名的干果和木本油料植物，与核桃、榛子、腰果并称为四大干果，在世界范围内扁桃的贸易量大、交易额高[4]。我国种植扁桃有1 300年以上的历史[3]。目前，扁桃主要集中在新疆喀什等地区，主栽品种为“纸皮”扁桃(Prunusdulcisvar. Zhipi)。该品种仁油脂质量分数54.7%～57.7%[3]，其中不饱和脂肪酸质量分数高达92.3%[5]，以油酸、亚油酸为主，可作为高档食用油，具有开发为基础油、按摩油、发用油、防锈油以及高档化妆品的潜力[3]。

水酶法是以水为介质，在机械破碎的基础上利用酶对植物组织的降解作用释放油脂的工艺。在我国，以水为介质制备芝麻油的历史长达1 600多年。水酶法中纤维素酶、果胶酶等能破坏细胞壁，而蛋白酶则渗透到脂质体膜内，对脂多糖、脂蛋白进行降解，这有利于油脂从脂质体中释放，进一步提高以水为介质提取油脂的效率[6-9]。水酶法的条件温和，酶解温度低，无需借助有机溶剂以及强酸、强碱的条件，得到的油脂成色好，副产物蛋白质等变性程度小[10]。

响应面优化即响应曲面设计方法(Response Surface Methodology，RSM)，其通过实验设计结合实验数据验证，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析获得最优工艺参数的一种高效方法。响应面优化被广泛应用到水酶法提取油脂工艺优化中，王新明等[9]利用响应面优化了红树莓籽油工艺油的制备工艺，高定烽等[11]利用响应面优化了芥末籽油的制备工艺。

本研究以“纸皮”扁桃为原料，采用水酶法制备“纸皮”扁桃油，在料液比、酶添加量、pH值、酶解时间、酶解温度等单因素实验的基础上，响应面设计获得最佳工艺参数，以期为“纸皮”扁桃等油脂资源利用和开发提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 原料与试剂

“纸皮”扁桃种仁，产自新疆喀什(阴干，含水量4.88%)，取仁、去皮、磨碎、过40目筛后-18 ℃储存备用。

氢氧化钠、盐酸、石油醚：分析纯；果胶酶Pectinex Ultra SP-L、纤维素酶Celluclast 1.5L、水解蛋白酶Alcalase 2.4L、风味蛋白酶Flavourzyme 500MG、中性蛋白酶Neutrase 1.5MG、复合蛋白酶Protamex。

1.1.2 仪器与设备

FSJ-A05B1型多功能粉碎机，HWS-12型电热恒温水浴锅，Kaida TGL16M型离心机，SCILOGEX MX-S涡旋振荡器，Five Easy Plus台式pH计。

1.2 方法

1.2.1 水酶法制备油脂工艺流程

称取定量样品，按料液比加入水，涡旋振荡2 min，调pH后，按实验需要加入适宜酶活单位的酶，涡旋振荡2 min，经恒温水浴提取后，利用冷冻解冻破乳(-20 ℃冷冻15 h以上，水浴锅40 ℃水浴解冻)后，5 000 r/min 离心20 min，收集上层油相(清油)，并称重，弃去乳相及水相，计算出油率。

出油率=(上层清油质量/脂肪含量)×100%

1.2.2 总含油率的测定

准确称取定量样品，用滤纸包好后，置于索氏提取器中，加入4倍量的石油醚，加热提取4 h；每份样品重复提取3次，50 ℃下减压蒸馏回收石油醚，真空干燥箱中干燥至恒重，得“纸皮”扁桃油，计算总含油率(油脂含量)。

总含油率=油脂总量/样品质量×100%

1.2.3 酶的筛选

称取5 g过40目筛“纸皮”扁桃仁粉末，料液比1∶5，酶解5 h，各种蛋白酶统一添加酶活6 000U/5 g，果胶酶和纤维素酶添加量为1%。各种酶最适酶解条件：中性蛋白酶pH 7.0，温度50 ℃；复合蛋白酶pH 7.0，温度50 ℃；水解蛋白酶pH 8.5，温度40 ℃；风味蛋白酶pH 6.0，温度40 ℃；果胶酶pH 5.5，温度55 ℃；纤维素酶pH5.5，温度55 ℃。

1.2.4 酶的配比

在pH值5.5、温度55 ℃、料液比1∶5、酶解5 h，固定果胶酶活性为800 U/5 g 调整水解蛋白酶添加活性，水解蛋白酶添加活性为4 000、5 000、6 000、7 000、8 000 U/5 g。

在pH值5.5、温度55 ℃、料液比1∶5、酶解5 h，固定水解蛋白酶活性为6 000 U/5 g调整果胶酶添加活性，果胶酶添加活性为200、400、800、1 200、1 600 U/5 g。

1.2.5 酶的添加顺序

在pH 5.5、温度55 ℃、料液比1∶5、酶解5 h，酶添加比例果胶酶∶水解蛋白酶=1∶5，对果胶酶和水解蛋白酶同一时间加入与先加入果胶酶酶解3 h后再加入水解蛋白酶酶解2 h进行比较。

2 结果与讨论

2.1 酶的筛选

如图1所示，各种酶与对照(出油率1.67%)相比出油率有不同程度的提高，其中，复合蛋白酶出油率最高达12.44%，其次是水解蛋白酶(11.99%)和果胶酶(11.60%)，纤维素酶出油率(2.22%)最低。复合蛋白酶出油率提升最高，说明酶的复合使用更有利于油脂的提取。胡滨等[6]利用复合酶制剂对丝瓜籽提取油脂同样获得了较好的效果。蛋白酶中水解蛋白酶出油率最高，达11.99%。水解蛋白酶主要作用于丝氨酸内部肽键，这说明“纸皮”扁桃油体细胞中的油脂可能被含有丝氨酸较多的蛋白质膜结构束缚。果胶酶主要作用于果胶和其他半乳糖醛酸结构中的α-1,4半乳糖苷键，与对照相比果胶酶显著提升了出油率，出油率达11.60%，这可能是果胶位于释放油脂分子的关键位置上。这与孙月娥等[10]利用果胶酶提取巴旦木油和水解蛋白效果最显著的结果一致。纤维素酶效果差于果胶酶，纤维素酶主要作用于纤维素中的β-1,4糖苷键，与对照相比加入纤维素酶对出油率提升有限，可能是因为纤维素中β-1,4糖苷键的水解对“纸皮”扁桃油脂的释放影响较小，而对丝瓜籽等油脂的释放可能起到至关重要的作用[6]。本实验使用的商品化复合蛋白酶，配方未知不利于后期提取工艺的优化。综上所述，本研究选用果胶酶与水解蛋白酶进行复配提取“纸皮”扁桃油。

图1 酶的种类对出油率的影响

2.2 酶的添加顺序

由图2可见，果胶酶和水解蛋白酶同时加入，出油率略低于分步加入。推测是因为果胶酶的化学本质为蛋白质，水解蛋白酶酶解果胶酶从而影响果胶酶的活性，一定程度上降低两种酶复配的效果。分步加入酶对出油率提高效果有限，对比出油率差异不显著。调整酶添加顺序不能有效地提高出油率，为减少操作步骤，控制生产过程中的成本，本研究仍采用同时加入两种酶开展后续工艺优化。使用复配酶提取油脂，大部分是采用同时加入，张会彦等[7]采用同步加入中性蛋白酶与戊聚糖酶用于胡麻籽油的提取。

注：“果”为果胶酶，“水”为水解蛋白酶。图2 酶添加顺序对出油率的影响

2.3 酶的添加量

由图3可知，果胶酶固定添加800 U/5 g，水解蛋白酶用量6 000 U/5 g时，出油率最高，达到31.08%。水解蛋白酶固定添加6 000 U/5 g，果胶酶用量为1 200 U/5 g时，出油率最高，达到37.75%。故选择水解蛋白酶添加活性为6 000 U/5 g和果胶酶添加活性为1 200 U/5 g(酶活性比例果胶酶∶水解蛋白酶=1∶5)复配，开展后续实验。李晓等[12]在红花籽油水酶法提取中添加酶活比例木聚糖酶:果胶酶碱性蛋白酶=1∶2∶3时提取率高达73%，这说明不同原料提取油脂对果胶酶的需求不同。

注：1～5分别表示800 U∶4 000 U，1 000 U∶5 000 U，1 200 U∶6 000 U，1 400 U∶7 000 U，1 600 U∶8 000 U(果胶酶∶水解蛋白酶)。图3 酶添加量对出油率的影响

2.4 酶的配比

pH 5.5、温度55 ℃、料液比1∶5，固定酶添加比例果胶酶∶水解蛋白酶=1∶5，添加量分别为800 U∶4 000 U，1 000 U∶5 000 U，1 200 U∶6 000 U，1 400 U∶7 000 U，1 600 U∶8 000U(果胶酶∶水解蛋白酶)，酶解5 h。结果见图3。

“纸皮”扁桃的出油率，在一定范围内随着酶的添加量的增加而提高，果胶酶∶水解蛋白酶=1 400 U∶7 000 U时出油率达到最高。再增加酶的添加量，出油率反而下降，可能是因为酶作为蛋白质，过量后有表面活性剂的作用，促进了油脂乳化，不利于其析出。

2.5 料液比对出油率的影响

在pH 5.5、温度55 ℃，酶添加量为果胶酶∶水解蛋白酶=1 200 U∶ 6 000 U，酶解5 h，研究料液比对出油率的影响。改变料液比分别为1∶4、1∶5、1∶7、1∶9、1∶11、1∶13，结果如图4所示。

图4 不同处理对出油率的影响

随着料液比中液体比例的增加，“纸皮”扁桃的出油率呈现先增加后下降的趋势，在1∶7之后变化不明显。液体占比小，物料黏稠度较大，不利于酶接触催化物料；液体占比过大，反应体系中酶与物料浓度均降低，减少了酶和物料中的底物分子发生接触的概率。因此液体占比过小或者过大均不利于油脂的提取。针对“纸皮”扁桃当料液比为1∶5时，出油率达到最高，故选择料液比为1∶5。

2.6 pH对出油率的影响

在55 ℃，料液比为1∶5，酶添加量为果胶酶∶水解蛋白酶=1 200 U∶6 000 U，酶解5 h，调节pH分别为2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5，检测pH对出油率的影响。由图4可知，随着pH值的增加，出油率先增加后降低，在pH3.5出油率最高，达到48.22%。推测可能是提取液偏酸更有利于果胶酶发挥酶活力，而pH变化对水解蛋白酶影响不大，故选择pH为3.5。

2.7 酶解温度对出油率的影响

在pH 5.5，料液比为1∶5，酶添加量为果胶酶∶水解蛋白酶=1 200 U∶ 6 000 U，酶解5 h，研究温度对出油率的影响。分别将温度设置为35、45、55、65、75 ℃。由图4可知，55 ℃时，出油率最高，达到37.73%，温度继续升高，出油率下降，这可能与酶的最适温度有关，果胶酶的适用温度范围为40～60 ℃，水解蛋白酶的适用温度范围为55～70 ℃。故选择酶解温度为55 ℃。

2.8 酶解时间对出油率的影响

在pH值5.5、温度55 ℃、料液比为1∶5，酶添加量为果胶酶∶水解蛋白酶=1 200 U∶6 000 U，研究酶解时间对出油率的影响，设置酶解时间分别为1、2、3、4、5、6 h。由图4可知，随着反应时间的延长，出油率增加，酶解3 h后，增加酶解反应时间，并不能显著增加出油率。推测酶解3 h基本已催化完全物料中的底物。而且“纸皮”扁桃油含有丰富的不饱和脂肪酸，反应时间延长会增加油脂的氧化的风险，增加能耗，故选择酶解时间为3 h。

2.9 响应面法优化结果与分析

2.9.1 响应面实验设计与结果

在单因素实验的基础上，综合显著性差异分析，根据Box-Behnken响应面设计原理，运用Design-Expert 11软件(Stat-Ease Inc., Minneapolis, MN, USA)，选择酶解pH(A)、料液比(B)、酶解温度(C)、酶添加量(D)四个因素为自变量，每个因素设计-1、0、1三个水平，具体因素水平见表1，每组实验重复3次以估计误差，以出油率(Y)为响应值，设计四因素三水平的响应面分析实验优化“纸皮”扁桃油水酶法提取工艺。响应面实验设计及结果见表2。

表1 “纸皮”扁桃油水酶法提取工艺响应面实验因素及水平

表2 “纸皮”扁桃油水酶法提取工艺响应面试验设计及结果

运用Design-Expert 11得到出油率(Y)对自变量酶解pH(A)、料液比(B)、酶解温度(C)、酶添加量(D)的二次多项回归模型：

Y=54.80+14.39A+1.79B-7.99C+2.98D-0.332 5AB-7.70AC+1.77AD+5.76BC+0.272 5BD+2.43AD-28.00A2-10.68B2-7.90C2-9.12D2

2.9.2 模型的建立及显著性分析

由表3还可看出，酶解pH(A)和酶解温度(C)对响应值出油率(Y)的影响极显著，交互项AC影响显著，说明酶解pH值和酶解温度交互作用显著。

表3 “纸皮”扁桃油水酶法提取工艺响应面回归方程模型方差分析

2.9.3 交互作用分析

响应面图能直接反映各因素与响应值的关系及各个因素间的交互作用，响应曲面坡度越陡、等高线密集成椭圆形表示两因素交互作用的影响越大，由图6可以看出，酶解pH和酶解温度交互作用对“纸皮”扁桃油水酶法提取出油率影响显著，随着酶解pH值的增大和酶解温度的上升，出油率先上升后下降。

图6 酶解pH与酶解温度对油提取率影响的响应面

2.9.4 纸皮”扁桃油最佳提取条件的确定及验证实验

通过响应面法优化得到的“纸皮”扁桃油水酶法最佳提取工艺参数为：酶解pH为3.81、料液比为1∶5.135、酶添加量为果胶酶:水解蛋白酶 (237.5 U∶1 187.6 U/g)、酶解温度为47.59 ℃，在此条件下“纸皮”扁桃的预测出油率为56.67%。为了验证该结果的可靠性，进行3次平行实验验证，结果取平均值，所得“纸皮”扁桃实际出油率为60.73%。实际验证值与理论预测值相比，相对误差6.68%，表明响应面优化后的“纸皮”扁桃油水酶法提取工艺可行，具有一定的实际利用价值。

3 结论

本研究利用水酶法提取“纸皮”扁桃油，通过单因素实验和响应面优化，得到水酶法提取“纸皮”扁桃油的最佳工艺参数为：选取果胶酶和水解蛋白酶，果胶酶和水解蛋白酶添加比例为1∶5(酶活性)、在酶解pH为3.81、料液比为1∶5.135、酶添加量为果胶酶∶水解蛋白酶=237.5 U∶1 187.6 U/g、酶解温度的为47.59 ℃、酶解时间3 h的条件下，“纸皮”扁桃的出油率可达60.73%