HPLC同时测定绛糖宁胶囊中5种活性成分的含量及聚类分析

刘源，丁广军，马灵珍

1.商丘市第一人民医院药学部，河南 商丘 476100；2.亳州职业技术学院药学院，安徽 亳州 236800

糖尿病是一种由胰岛素分泌或利用缺陷引起的代谢性疾病。随着人均寿命延长及老龄化社会的到来，我国糖尿病流行趋势严峻，成为重要公共卫生问题，严重威胁到患者的身心健康［1,2］。中药制剂以疗效突出，毒副反应小，深受广大患者欢迎。绛糖宁胶囊具有益气养阴、生津止渴的功效，临床上主要用于多饮、多尿、多食、体倦无力、脉细数无力等糖尿病患者的治疗。绛糖宁胶囊由太子参、天花粉、黄芪、地黄等7味中药组成，现行标准为国家标准WS-11448（ZD-11448）-2002-2011Z［3］，标准仅对黄芪所含黄芪甲苷进行了定量分析。为了确保制剂的安全性、有效性，进一步全面科学地评价产品质量，多指标成分质量控制模式近年来已广泛应用于其质量控制中。本实验采用HPLC梯度洗脱法对绛糖宁胶囊中君药黄芪所含活性成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷和毛蕊异黄酮，臣药天花粉所含特征成分葫芦素B以及佐药太子参所含太子参环肽B5种成分同时进行含量测定，建立绛糖宁胶囊多指标成分质量控制模式，并采用SPSS 26.0统计软件对所测含量进行聚类分析，为全面评价和提升绛糖宁胶囊整体质量提供数据支持。

1 仪器与试药

Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；CPA225D型电子天平（德国赛多利斯公司）。葫芦素B对照品（批号：111945-201301，含量：96.9%，CAS号6199-67-3）和毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（批号：111920-201907，含量：96.8%，CAS号20633-67-4）来源于中国食品药品检定研究院；太子参环肽B对照品（批号：18031328，含 量：99.9%，CAS号145459-19-4）、芒柄花苷对照品（批号：17081841，含量：98.1%，CAS号486-62-4）和毛蕊异黄酮对照品（批号：17050931，含量：99.6%，CAS号20575-57-9）来源于上海同田生物技术股份有限公司；乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯；绛糖宁胶囊（生产企业：贵州联盛药业有限公司；批号：190204、190207、190211、190302、190901、190903、200105、200109、200201、200204，编号分别为S1～S10；批准文号：国药准字Z20 044486；规格：每粒装0.4 g）。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品溶液的制备精密称取太子参环肽B、葫芦素B、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷和毛蕊异黄酮对照品各适量，用甲醇制成质量浓度分别为0.232、0.128、1.756、1.054和0.718 mg/mL的混合对照品贮备液。精密吸取混合对照品贮备液0.10、0.20、0.50、1.00、1.50和2.00 mL，分别置于6个20 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制成6个系列质量浓度线性考察混对溶液Ⅰ～Ⅵ；取线性考察混对溶液Ⅳ作为混合对照品溶液（太子参环肽B 11.6 μg/mL、葫芦素B 6.4 μg/mL、毛蕊异黄酮葡萄糖苷87.8 μg/mL、芒柄花苷52.7 μg/mL和毛蕊异黄酮35.9 μg/mL）。

2.1.2 供试品溶液和阴性样品溶液的制备取绛糖宁胶囊内容物研细，取约2.0 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加甲醇适量，加热回流提取45 min，放冷后用甲醇定容至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得绛糖宁胶囊供试品溶液。按绛糖宁胶囊质量标准中的处方工艺，分别制备不含太子参、不含天花粉和不含黄芪的阴性样品，再按上述方法制成阴性样品溶液。

2.2 色谱条件

采用Diamasil C18液相色谱柱（200 mm×4.6 mm，5 μm），柱温：30 ℃；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～14.0 min，36.0%A；14.0～21.0 min，36.0%→48.0%A；21.0～28.0 min，48.0%→52.0%A；28.0～43.0 min，52.0%→64.0%A；43.0～50.0 min，64.0%→36.0%A），流速：0.9 mL/min；进样量：10 μL；检测波长：203 nm（0～21.0 min检测太子参环肽B）［4-6］、227 nm（21.0～28.0 min检测葫芦素B）［7-9］和254 nm（28.0～50.0 min检测毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷和毛蕊异黄酮）［10-12］，理论板数按各目标化合物色谱峰计均不得低于3 000。精密吸取2.1.1项下混合对照品溶液及2.1.2项下溶液各10 μL，进样检测，记录色谱图。结果供试品色谱图中太子参环肽B、葫芦素B、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷和毛蕊异黄酮色谱峰峰形好，分离度均≥1.5，阴性样品对绛糖宁胶囊中太子参环肽B、葫芦素B、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷和毛蕊异黄酮的测定无干扰，色谱图见图1。

2.3 线性关系考察

分别精密吸取“2.1.1”项下6个系列质量浓度线性考察混对溶液适量，依次进样测定绛糖宁胶囊中5种成分的峰面积，以太子参环肽B、葫芦素B、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷和毛蕊异黄酮质量浓度（X，μg/mL）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得5种成分的回归方程、线性范围及r值见表1。

表1 5种成分的回归方程、相关系数和线性范围

2.4 精密度考察

取“2.1.1”项下混合对照品溶液连续进样6次，记录太子参环肽B、葫芦素B、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷和毛蕊异黄酮的峰面积，计算5种成分峰面积的RSD分别为0.89%、1.10%、0.56%、0.71%和0.82%。

2.5 重复性考察

取绛糖宁胶囊样品，按“2.1.2”项下方法配制6份绛糖宁胶囊供试品溶液，依法进样分析，记录太子参环肽B、葫芦素B、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷和毛蕊异黄酮的峰面积并计算各目标化合物的含量，结果5种成分含量的RSD分别为1.64%、1.89%、1.16%、1.28%和1.55%。

2.6 稳定性考察

临用新配制一份绛糖宁胶囊供试品溶液，于配制后0、2、6、12、18和24 h进样检测太子参环肽B、葫芦素B、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷和毛蕊异黄酮的峰面积，结果5种成分峰面积的RSD分别为0.91%、1.07%、0.52%、0.66%和0.75%，表明绛糖宁胶囊供试品溶液24 h内稳定。

2.7 加样回收率试验

取5种目标化合物含量均已知的同一批次绛糖宁胶囊内容物，研细后，取9份，每份约1.0 g，精密称定，随机3份分为1组，依据《中国药典》2015年版四部规定，分别精密加入混合对照品溶液（太子参环肽B 0.057 mg/mL、葫芦素B 0.036 mg/mL、毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.489 mg/mL、芒柄花苷0.271 mg/mL、毛蕊异黄酮0.193 mg/mL）1.0 mL，2.0 mL和3.0 mL各1组，使对照品加入量约为样品原有量的50%，100%和150%，再按“2.1.2”项下方法制成加样回收样品溶液，依法进样测定太子参环肽B、葫芦素B、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷和毛蕊异黄酮的峰面积，计算目标化合物含量，用测得量与样品原有量之差除以对照品加入量计算5种成分的回收率及RSD值，结果见表2。

表2 绛糖宁胶囊中5种成分的加样回收率

（续表）

2.8 样品含量测定

取10个批次的绛糖宁胶囊样品，按“2.1.2”项下方法制成供试品溶液（每批样品平行制备3份），依法进样检测太子参环肽B、葫芦素B、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷和毛蕊异黄酮的峰面积，计算5种成分的含量，结果见表3。

表3 10批绛糖宁胶囊样品的含量（n=3） mg/g

2.9 聚类分析

为考察不同批次绛糖宁胶囊中5种成分太子参环肽B、葫芦素B、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷和毛蕊异黄酮的含量差异，利用SPSS 26.0统计软件，以表3中各目标化合物的含量测定结果为变量，对10个批次的绛糖宁胶囊样品进行聚类分析（聚类方法设定为组间联接，测量区间设定为欧氏距离），结果见图2。由图可知，当类间距离为10时，10批样品聚为3类，样品S8、S10、S9和S7聚为第Ⅰ类，样品S1、S3、S2和S4聚为第Ⅱ类，样品S5和S6聚为第Ⅲ类；当类间距离为20时，10批样品聚为2类，第Ⅰ类和第Ⅱ类合并为一类，第Ⅲ类为一类。从分类结果可以看出，目标化合物含量差异与绛糖宁胶囊样品批次期间有关，可能与制剂生产所用原药材产地、采收季节等因素引起的批间质量差异有关。

3 讨论

3.1 流动相的选择

本实验首先对流动相进行了优化选择，分别对比考察了乙腈-水［4-6］、甲醇-水［7,8］、乙腈-0.1%冰醋酸溶液［9］、乙腈-0.1%甲酸溶液［10,11］和乙腈-0.1%磷酸溶液［12］5个流动相体系。结果以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相系统进行梯度洗脱检测时，色谱图基线平稳，5种成分太子参环肽B、葫芦素B、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷和毛蕊异黄酮色谱峰峰形对称，分离度较好，杂质干扰小，同时对流动相梯度洗脱比例进行了摸索，最终确定采用“2.2”项下的色谱条件检测绛糖宁胶囊中太子参环肽B、葫芦素B、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷和毛蕊异黄酮的含量。

3.2 供试品提取方式的选择

在绛糖宁胶囊样品处理时，本实验参考相关文献以甲醇［4-6,9-12］为溶剂，分别比较超声提取［4-13］、加热回流提取［12］两种提取方式对太子参环肽B、葫芦素B、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷和毛蕊异黄酮综合提取率的影响，结果加热回流提取优于超声提取，遂对提取时间（30、45、60 min）进行不断摸索，最终确定采用甲醇加热回流45 min为绛糖宁胶囊供试品提取方法。

本实验采用HPLC法对绛糖宁胶囊中太子参环肽B、葫芦素B、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷和毛蕊异黄酮5种成分含量进行同时测定，建立了绛糖宁胶囊多指标成分的质量控制模式，从表3中各目标化合物含量测定结果来看，所测各成分具有一定的批间差异，表明本实验所建立的方法对绛糖宁胶囊的质量控制具有重要意义。同时通过SPSS 26.0统计软件中聚类分析等化学计量学手段对10个批次绛糖宁胶囊样品中5种化合物质量进行综合评价，结果表明目标化合物含量差异与绛糖宁胶囊样品批次期间有关，提示药品生产企业加强原药材来源质量控制和制剂生产过程参数控制。本实验所建立的方法操作便捷、结果准确，可用于绛糖宁胶囊的质量控制，为该制剂的质量标准提升提供了有力的实验数据。