高效液相色谱法检测茶叶中掺杂蔗糖的含量

本文用反相高效液相色谱检测茶叶中蔗糖的含量，将茶叶中的蔗糖用纯水提取，离心，通过0.45μm 的滤膜过滤脱气，流动相为水和乙腈(30：70)，流速为1.0mL/min，色谱条件为ZORBAX Carbohydrate；色谱柱4.6mm×250mm，粒度5μm；柱温40℃；示差折光检测器。采用标准曲线法，得到的标曲曲线线性关系良好，适合于茶叶中蔗糖的检测。

茶叶味苦、甘，微寒，入心、肺、脾经。茶叶有清热降火、祛风解暑的作用。治疗外感风寒引起的头痛、鼻塞，可以用茶叶跟生姜、白芷配伍[1]。风热上扰引起的头目昏痛，可用茶叶跟川芎、薄荷配伍。中暑引起的头痛、烦躁、口渴，可以用茶叶跟西瓜皮同用。茶叶还有解毒、止泻痢的作用，对于急性细菌性痢疾、慢性细菌性痢疾的急性发作，可以把茶叶研磨冲服。急性腹泻、下痢不止，可以把茶叶和生姜水煎服。痔疮出血，可以把茶叶炒焦存性，米汤送服。

近年来，蔗糖添加在茶叶(特别是红茶)生产中时有发生[2]。茶叶加工中所添加的蔗糖一方面可在香气、色泽等方面影响对成茶的感官品质评判；同时，由于蔗糖易吸潮、易变质和易滋生细菌等特点，对茶叶质量安全有较大的影响。目前，对于基质简单的食品中糖类成分样品检测可选方法相对较多；但对于基质较复杂的食品(如茶叶等)样品中的蔗糖检测，由于基质复杂，直接检测干扰太多，很难直接检测出蔗糖含量，一般需先分离干扰基质再检测，多采用液相色谱法。茶叶中含有各种糖类，是构成茶叶滋味的重要成分之一[3]。在进行茶叶加工的过程中，糖类发生非酶促褐变作用，生成醛和吡咯，对形成茶叶的色泽和香气有重要影响。部分可溶性糖是影响茶汤是否醇正的主要影响因素。《食品中还原糖的测定方法》等文章介绍了检测分析糖类的成分的几种方法，这些方法存在一定的弊端，如时间长，定量测定不准，耗时耗力，无法自动化操作，实验仪器昂贵使用不便等。随着我国定量分析测定技术的提升，高效液相色谱法（HPLC）发展成为糖类检测中最有效的方法[4]，能将多种糖类逐一分离进行分析，能将物质中糖类含量准确地进行定性定量分析，成为糖类分析最重要最准确的方法之一。目前我国已广泛使用高效液相色谱法（HPLC）分析食品中的糖类。

1.材料与方法

1.1 仪器

高效液相色谱仪LC1260 安捷伦科技有限公司，示差折光检测器 安捷伦科技有限公司，ZORBAX Carbohydrate柱 4.6mm×250mm.粒度5um，默克密理博纯水机，美国贝克曼离心机，超声脱气机，梅特勒电子天平

1.2 试剂

蔗糖标准品、乙腈、蒸馏水

1.3 实验材料

市售茶叶

1.4 色谱柱的前处理

用已配制好的水和乙腈(30：70)缓冲溶液过0.45μm 的滤膜超声处理之后脱气，以1.000mL/min 的流速洗柱12h保持柱温40℃。

1.5 色谱条件

流动相：水和乙腈(30：70)，流速为1.0mL/min

色谱柱：ZORBAX Carbohydrate 柱 4.6mm×250mm.粒度5μm，柱温40℃

示差折光检测器

进样量：20μL。

1.6 标准样品的配制

1.6.1 蔗糖标准储备液（20mg/mL）：

称取蔗糖标准品0.2g（精确至0.0001g）于10mL 容量瓶中，用水定容至刻度，混匀，浓度为20mg/mL，有效期一个月，4℃冰箱保存。

1.6.2 蔗糖标准使用液：

分别吸取蔗糖标准储备液0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.5mL、5mL 于50mL 容量瓶中，用水定容。分别相当于：0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL 浓度标准溶液。分别进标准溶使用液系列各20μL，进行HPLC 分析，然后以峰面积为纵坐标，蔗糖的浓度为横坐标，绘制标准曲线，化学工作站完成，建立校正表[5]。

1.6 样品前处理及检测

取市售茶叶5g 加20mL 水，超声30min，静置，待冷却后取上清液于离心管中，以4000r/min 离心10 分钟，取上清液于50mL 容量瓶中，重复一遍，合并上清液。然后用0.45μm 滤膜过滤后脱气待测。取蔗糖样品20μL 进样检测峰面积。

2.结果与分析

2.1 线性回归方程和检出限

通过对标准样品和茶叶样品的进样，得标准样品色谱图，标准曲线图和茶叶样品色谱图。其中，检测限是分析物蔗糖的信噪比为 3(S/N=3)时所对应的浓度。结果表明，蔗糖的检测线性回归方程的相关性良好，检出限为 0.10 g/100 g。

表1 不同蔗糖含量对应得峰面积

图1 峰面积—标准蔗糖浓度mg/mL

其中Y 为峰面积，X 为浓度（mg/mL） 将样品峰面积Y 代入公式求X，可以得到茶叶中蔗糖的浓度C。

表2 线性回归方程、线性相关系数、检出限

2.2 结果计算

X=c×V/（m×10）

式中：

X---试样中蔗糖的含量，单位（g/100g）；

c---由标准曲线查的试样进样液中蔗糖的浓度，单位（mg/mL）；

V---试样定容体积，单位（mL）；m---试样质量，单位（g）；10---换算系数。

结果保留三位有效数字。

表3 不同茶叶中蔗糖的含量

如图所示，疑似掺糖茶叶蔗糖含量为1.918g/100g，自制掺糖茶叶蔗糖含量为2.303g/100g，秀水天香茶叶蔗糖含量为0.378g/100g，武当山茶叶蔗糖含量为0.377g/100g。其中自制茶叶加糖前后蔗糖含量对比明显。秀水天香茶叶与武当山茶叶受海拔、土壤、光照及降水[6]等种植条件的影响，蔗糖含量明显高于自制茶叶。

2.3 回收率实验

以秀水天香绿茶为绿茶的基质，在最优条件下进行 3个水平的加标回收试验，每个

水平重复 6 次，按 1.6 方法处理，加标结果分别见表 4。结果表明，蔗糖的回收率在 87.9 %～98.6 %之间，RSD %在 1.33 %～2.14 %之间。

表4 绿茶中蔗糖的加标回收率

3 讨论

3.1 流动相及流速的选择

水和乙腈(30：70)体系对蔗糖有较好的溶解度和选择性，和别的杂质有较好的分离度。选择流速时，对峰形对称性有影响[7]，由于液相色谱的柱长250mm，柱径4.6mm 已经确定，就须选择与之柱子匹配的流量，一般对于250mm、4.6mm、5μm 的填料最佳流量为1.000mg/min。

3.2 色谱柱的选择

本次实验采用安捷伦ZORBAX Carbohydrate 糖分析专用柱。糖分析柱具有重现性好、高效和使用灵活的特点。每一批这种特殊用途的氨基丙基柱填料都要经过分离单糖和二聚糖的测试。这个色谱柱采用ZORBAX 多孔硅胶微球技术[8]。糖分析柱可进行大体积进样，4.6 x 150 mm 色谱柱可以进样50 μL。

3.3 适宜温度

实际分析中改变柱温对液相色谱的分离选择性，分离速度，流动相黏度，柱前压等均会产生影响。色谱柱温太高，流动相黏度降低，有利于增大柱的通透性，可加快分析速度，可在一定程度上提供分离选择性，但是会降低色谱柱的使用寿命，一般设置温度为室温，本实验设置温度为40°

3.4 定性定量方法

以保留时间进行定性，通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰[9]，来确定试样中是否含有蔗糖及在色谱图中的保留位置。此实验用外标法进行定量，在一定的色谱条件下，检测器的响应信号，即色谱图上的峰面积与进入检测器的浓度成正比，这是蔗糖定量的基础，对样品进行定量有归一化法，外标法和内标法；归一化法要求对样品中所有组分全部出峰，由于该方法使用的标准试剂是分析纯，含有的杂质较多，有归一化法定量将产生较大的误差。内标法的准确度较高，但对于每个试样的分析，都要先进行2 次称量[10]，不适合大批量样品的快速分析。外标法配置一系列标准溶液进行色谱分析，外标法不使用校正因子，准确度较高，但操作条件变化对准确性影响较大，适用大批量试样的快速分析，因此本实验采用外标法进行定量。

3.5 注意事项

由于流动相是分析纯其中杂质较多[11]，使一些谱图出现前伸峰；柱温的不稳定这些因素导致蔗糖的保留时间有所差别，在精度要求的范围内均影响不大。本实验采用外标法[12]进行定量，确定了RP—HPLC 与其它物质的最佳分离条件，此方法准确度较高适用于大批量试样的快速分析，适合于茶叶中蔗糖含量的测定[13]。

3.6 结论

利用本实验方法，对本地绿茶100 批次的检测，得出蔗糖含量在5%～1%之间的样品，为可疑掺糖样品，含量在1%以上的，可以基本确定掺杂了蔗糖。