乙烯利和硒复配剂对铁皮石斛抗寒性的影响

丁久玲 郑凯 史俊

摘要：为研究低温胁迫下外源乙烯利和硒复配剂处理对铁皮石斛抗寒性的影响，将铁皮石斛幼苗在2 ℃下低温胁迫7 d后，用不同浓度的外源乙烯利和硒复配剂进行叶面喷施，其中外源乙烯利和外源硒均设置了4个浓度梯度，分别为0、2、5、10 mg/L和0、5、7.5、10 mg/L，采用不完全随机设计将二者进行复配，共设12种复配剂。结果表明，低温胁迫下外源乙烯利和硒应配合使用，具体表现为可使叶绿素含量和脯氨酸（PRO）含量增加，过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性增强，丙二醛（MDA）含量下降;喷施浓度为2/7.5、5/7.5、2/10（mg/L）/（mg/L）的乙烯利和硒复配剂可使铁皮石斛叶绿素含量、PRO含量、抗氧化酶活性增加，MDA含量下降，从而提高铁皮石斛的抗寒性，降低植物受到的低温伤害。

关键词：铁皮石斛;低温胁迫;乙烯利;硒;抗寒性

中图分类号：S567.23+9.01   文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）20-0164-06

铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是我国传统的名贵中药材，具有健胃、滋阴、清热解毒、提高免疫力等功效。低温会抑制铁皮石斛幼苗的成活和生长，是影响其生存与分布的主要因素。因此，增强铁皮石斛幼苗的抗寒能力，寻找一种有效缓解低温伤害的方法是提高铁皮石斛幼苗成活率及产量的关键，亦是铁皮石斛种植和生产中亟待解决的问题。

乙烯利是一种植物生长调节剂，有研究认为，乙烯利可以提高香蕉、葡萄等植物的抗寒性[1-3]。硒（Se）是对植物生长发育有益的营养元素，可参与植物体内的氧化还原反应，清除脂质过氧化物等自由基，减少胁迫对生物膜等造成的机体过氧化损伤，从而降低胁迫带来的伤害，在植物抗逆中的作用越来越受到重视。目前，涉及硒提高植物抗寒性的研究较少，孙丽等研究认为，适宜浓度的硒可以减弱低温对草莓、萝卜、番茄等幼苗[4-6]的伤害，提高植物的耐寒性。关于乙烯利和外源硒配合使用提高植物耐寒性的研究至今处于空白状态。

目前对于铁皮石斛的研究多集中于组培[7-9]、栽培[10-12]、药用[13-14]等方面，涉及低温胁迫的文献相对较少[15-16]，对于添加乙烯利、硒缓解低温胁迫的研究报道更少，马环等研究发现，乙烯利可提高铁皮石斛的抗寒性[17];张艳嫣等研究发现，适量浓度外源硒可使铁皮石斛幼苗的耐冷性增强[18]。乙烯利和硒配合使用对低温胁迫下铁皮石斛的抗寒性是否有影响尚未见报道。本研究基于外源物（乙烯利和硒）可有效緩解植物低温伤害的理论知识，揭示乙烯利和硒配合使用对低温胁迫下铁皮石斛幼苗的影响和低温伤害的缓解作用，探讨有效缓解铁皮石斛低温伤害的外源物（乙烯利和硒复配剂）的适宜浓度等关键技术难题，以期为提高铁皮石斛的产量和低温胁迫下幼苗成活率等生产问题提供理论指导，并为铁皮石斛在我国大范围推广应用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

以出瓶栽培1年的铁皮石斛组培苗为供试材料，将其栽培于江苏农林职业技术学院农博园大棚内。

1.2 试验设计

从温室栽培床上挖出生长均匀、无病虫害的盆栽铁皮石斛幼苗，移栽到具有铁皮石斛专用基质的塑料花盆（规格为高18 cm、底面直径15 cm）中，每盆6株。置于大棚内正常培养15 d后置于医用冷藏箱内在2 ℃下低温胁迫7 d，然后进行外源乙烯利和硒复配剂处理。

外源乙烯利和外源硒均设置了4个浓度梯度，分别为0、2、5、10 mg/L和0、5、7.5、10 mg/L，采用不完全随机设计将二者进行复配，共获得12种复配剂处理，具体为外源乙烯利浓度/外源硒浓度：0/0、5/0、0/7.5、2/5、2/7.5、2/10、5/5、5/7.5、5/10、10/5、10/7.5、10/10（mg/L）/（mg/L），其相应编号分别为Y1（对照，即只喷水）、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11、Y12。每个处理3次重复。外源硒用分析纯亚硒酸钠（Na2SeO3），外源乙烯利为40%乙烯利水剂。复配剂以叶面喷施的形式进行施用，喷洒至叶片完全湿润有水珠滴落为准，之后置于人工气候箱内培养20 d。人工气候箱条件设定：温度为25 ℃，光照度为4 000 lx，光—暗周期为 12 h—12 h。在培养过程中，定期观察植物生长状况并进行正常管理。复配剂处理20 d后采集倒3～5张叶片，置于-75 ℃低温冰箱中进行保存，用于生理指标的测定。

1.3 测定项目

叶绿素含量参照《植物生理生化实验原理与技术（第二版）》[19]中的叶绿体色素含量测定方法进行测定。

脯氨酸（PRO）含量的测定利用脯氨酸分光光度计试剂盒法。

丙二醛（MDA）含量的测定利用丙二醛分光光度计试剂盒法。

超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定利用超氧化物歧化酶分光光度计试剂盒法，试剂盒由苏州科铭生物技术有限公司（下同）提供。

过氧化物酶（POD）活性的测定利用过氧化物酶分光光度计试剂盒法。

过氧化氢酶（CAT）活性的测定利用过氧化氢酶分光光度计试剂盒法。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫下乙烯利和硒复配剂对铁皮石斛叶绿素含量的影响

叶绿素可以吸收、传递光能，其含量多少在一定程度上决定了植物对光的吸收和利用效率，常常作为研究光合生理的重要指标[20]之一。植物体内叶绿素含量的增加可以在一定程度上提高其光合速率，促进植物生长，进而间接提高抗逆性。由图1可知，不同浓度的外源乙烯利和硒复配剂对低温胁迫下铁皮石斛叶绿素含量的影响不同。Y5处理的叶绿素含量最高，其次是Y8、Y6、Y7、Y4、Y9处理，这6个处理间叶绿素含量差异不显著，除Y9处理外，其他5个处理均显著高于对照（Y1）;Y10、Y11、Y12处理的叶绿素含量均显著低于对照，3个处理间叶绿素含量差异不显著。低温胁迫下不同浓度外源乙烯利和硒复配剂处理的铁皮石斛叶绿素含量表现为Y5>Y8>Y6>Y7>Y4>Y9>Y3>Y2>Y1>Y11>Y12>Y10。Y2、Y3处理为单一使用外源乙烯利或硒的处理，其叶绿素含量稍高于对照（Y1），但与对照差异不显著。据此可初步判断，低温胁迫下外源乙烯利和硒配合使用可增加铁皮石斛叶绿素含量，且二者配合使用时适宜的浓度可使铁皮石斛叶绿素含量显著增加，复配剂的浓度过高或过低均会影响叶绿素含量的增加。本研究认为，适宜浓度的外源乙烯利和硒复配剂（Y4、Y5、Y6、Y7、Y8处理）可以显著提高低温胁迫下铁皮石斛的叶绿素含量，促进植物生长。

2.2 低温胁迫下乙烯利和硒复配剂对铁皮石斛PRO含量的影响

研究表明，在低温胁迫下，植物可通过体内PRO含量的显著增加来缓解受到的伤害，从而提高抗寒性[21]。由图2可知，不同浓度的乙烯利和硒复配剂对低温胁迫下铁皮石斛PRO含量的影响各不相同。12组处理中，Y5处理的PRO含量最高，其次是Y6、Y8、Y4、Y9、Y7处理，这6个处理的PRO含量差异不显著，均高于对照，其中Y5、Y6处理显著高于对照;Y10处理的PRO含量最低，其次是Y11、Y2、Y12、Y3、Y1、Y7、Y9处理，8个处理间PRO含量差异不显著且均较低。低温胁迫下不同浓度乙烯利和硒复配剂处理的铁皮石斛PRO含量表现为Y5>Y6>Y8>Y4>Y9>Y7>Y1>Y3>Y12>Y2>Y11>Y10。Y2、Y3处理为单一使用乙烯利或硒的处理，其PRO含量与对照相比差异不显著且均较低。据此可判断，低温胁迫下乙烯利和硒应配合使用才可明显地增加铁皮石斛的PRO含量。乙烯利和硒配合使用时浓度过高或过低均不利于PRO含量的增加，只有在浓度适宜时才可显著提高铁皮石斛的PRO含量。本研究认为，Y5、Y6处理的乙烯利和硒复配剂可以显著提高低温胁迫下铁皮石斛的PRO含量，进而提高其抗寒性。

2.3 低温胁迫下乙烯利和硒复配剂对铁皮石斛MDA含量的影响

植物器官在低温逆境下，往往会发生膜脂过氧化作用，MDA是膜脂过氧化作用的产物之一，通常将其含量作为脂质过氧化指标，反映细胞膜脂过氧化程度和植物对低温逆境条件反应的强弱，其含量高低与植物抗寒性强弱呈反比。由图3可知，不同浓度的外源乙烯利和硒复配剂对低温胁迫下铁皮石斛MDA含量的影响不同。Y6处理的MDA含量最低，与对照相比下降最为显著，其次是Y8、Y4、Y9、Y7、Y5处理，这6个处理的MDA含量差异不显著，且后5个处理与对照相比差异不显著。Y10处理的MDA含量最高，其次是Y1、Y12、Y3、Y2、Y11处理，这6个处理差异不显著且均较高。低温胁迫下不同浓度的外源乙烯利和硒复配剂处理的铁皮石斛MDA含量表现为Y6

2.4 乙烯利和硒复配剂对低温胁迫下铁皮石斛抗氧化酶活性的影响

2.4.1 乙烯利和硒复配剂对低温胁迫下铁皮石斛SOD活性的影响 超氧阴离子自由基是在生物氧化、电子传递过程中产生的，可参与物质代谢过程、诱发细胞的一些不良反应等。当植物遭遇低温胁迫时，细胞中的超氧阴离子自由基积累过多，从而氧化、破坏生物大分子，甚至导致细胞死亡，而SOD可清除超氧阴离子自由基，缓解植物受到的不良伤害。由图4可知，不同浓度的乙烯利和硒复配剂对低温胁迫下铁皮石斛SOD活性的影响有所不同。Y5、Y7、Y8处理与对照相比，SOD活性明显上升;Y3、Y4、Y6这3个处理的SOD活性稍高于对照，与对照差异不显著;Y9、Y10、Y11、Y12处理的SOD活性低于對照。低温胁迫下不同浓度的乙烯利和硒复配剂处理的铁皮石斛SOD活性表现为Y8>Y5>Y7>Y4>Y6>Y3>Y1>Y2>Y9>Y11>Y10>Y12。

Y2处理和Y3处理分别为单一使用乙烯利和硒的处理，与对照相比，SOD活性差异不显著，故认为，低温胁迫下乙烯利和硒应配合使用才可明显增加铁皮石斛的SOD活性，从而提高其抗寒性。本研究认为，适宜浓度的乙烯利和硒复配剂（Y5、Y7、Y8处理）可明显提高低温胁迫下铁皮石斛的SOD活性，可在一定程度上减少低温胁迫造成的超氧阴离子自由基的积累，从而有效缓解铁皮石斛受到的低温伤害。

2.4.2 乙烯利和硒复配剂对低温胁迫下铁皮石斛POD活性的影响 研究表明，POD是植物体内抗氧化系统的组成部分，具有抵御组织细胞发生膜质过氧化的作用，POD活性高低与植物抗寒性强弱密切相关[22]。从图5可以看出，不同浓度的乙烯利和硒复配剂对低温胁迫下铁皮石斛POD活性的影响不同。Y6处理的POD活性最高，显著高于其他处理;其次是Y4、Y8、Y7、Y9、Y5处理，这5个处理间POD活性差异不显著;Y11处理的POD活性最低，其次是Y2、Y3、Y10、Y12、Y1处理，均较低。低温胁迫下不同浓度的乙烯利和硒复配剂处理的铁皮石斛POD活性表现为Y6>Y4>Y8>Y7>Y9>Y5>Y10>Y3>Y2>Y12>Y1>Y11。Y2处理和Y3处理分别为单一使用外源乙烯利和硒的处理，其POD活性与对照相比差异不显著且均较低。由此可知，单一施用乙烯利或硒也可以提高POD活性，但是效果不佳，只有在二者相互配合且乙烯利浓度不得过高的情况下POD活性才会显著增加，POD活性的增强可提高铁皮石斛的抗寒能力，缓解低温胁迫的伤害。乙烯利和硒复配剂可以在一定程度上提高铁皮石斛的POD活性，但复配剂的浓度过高或过低均不利于POD活性稳定增加，只有在浓度适宜时才可显著提高铁皮石斛的POD活性。本研究认为，Y6处理的乙烯利和硒复配剂可以显著提高低温胁迫下铁皮石斛的POD活性。

2.4.3 乙烯利和硒复配剂对低温胁迫下铁皮石斛CAT活性的影响 CAT是植物在逆境条件下酶促防御系统的关键酶之一，在植物胁迫应答以及控制细胞的氧化还原平衡等方面起着重要的作用，可催化H2O2分解为H2和O2[23]。由图6可知，不同浓度的乙烯利和硒复配剂对低温胁迫下铁皮石斛CAT活性的影响均不显著。Y5、Y8处理的CAT活性较高，对照的CAT活性最低。低温胁迫下不同浓度的外源乙烯利和硒复配剂处理的铁皮石斛CAT活性表现为Y5>Y8>Y6>Y7>Y4>Y9>Y12>Y3>Y10>Y11>Y2>Y1。外源乙烯利和硒复配剂对铁皮石斛CAT活性有一定的促进作用，但效果不显著。