广西的尼里-拉菲水牛和摩拉水牛mtDNA D-loop区遗传多样性研究

李 双，汤嘉玉，王自豪，黄光云，滕少花，曹艳红，雷初朝，孙俊丽*

(1.广西壮族自治区畜牧研究所,广西家畜遗传改良重点实验室，广西 南宁 530001；2.西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

家养水牛是热带亚热带地区的重要家畜，可以为人类提供奶、肉、皮等。根据形态特征、行为习性、染色体核型等可以将家养水牛分为沼泽型(2n= 48)和江河型水牛(2n=50)两个类型[1-2]。沼泽型水牛多为役用，主要分布在中国南方、东南亚等地区，而江河型水牛多为乳用，主要分布在南亚、地中海和南欧等地区[2-3]。尼里-拉菲水牛是世界上优良的江河型水牛品种之一，原产于巴基斯坦旁遮普省中部，于1974年引入我国[4]。摩拉水牛是世界著名的江河型乳用水牛品种，原产于印度，于1957年引入我国[4]。

线粒体是真核生物细胞中极其重要的细胞器，同时也是重要的遗传信息载体。哺乳动物的线粒体DNA(mtDNA)是一个双链闭合的环状DNA分子，约16.5 kb，无组织特异性，具有遵循母系遗传、结构简单稳定、无重组、进化速度快等特点，在母系遗传多样性、系统进化、群体遗传学等领域都有广泛应用[5]。线粒体DNA的进化速率比单拷贝核DNA高5～10倍，且线粒体DNA D-loop区的进化速率又比其他区域高5～10倍。和其他哺乳动物一样，水牛的mtDNA是由37个蛋白编码基因和一段910 bp的D-loop区组成[6]。近年来，采用mtDNA序列已开展了一些水牛品种的遗传特征和群体遗传变异研究，结果表明沼泽型水牛与江河型水牛是独立驯化而来，其中，沼泽型水牛mtDNA分为两个主要支系(SA与SB)及3个稀有支系(SC、SD、SE)，而江河型水牛mtDNA分为3个支系：R1、R2、R3[7-11]。

本研究主要对引入广西南宁的尼里-拉菲水牛和摩拉水牛mtDNA D-loop区序列进行PCR扩增与测序，以分析广西南宁的尼里-拉菲水牛和摩拉水牛的遗传多样性及其与沼泽型水牛的杂交情况。

1 材料与方法

1.1 样品采集

从广西南宁采集52个江河型水牛血样(尼里-拉菲水牛25个，摩拉水牛27个)。从GenBank下载20条尼里-拉菲水牛D-loop序列(其登录号为：KR008567-KR008586)和23

条摩拉水牛D-loop序列(其登录号为：AF197209-AF197211、AF197213、AF197215-AF197217、AF475204-AF475210、AF475212-AF475218、AY195591-AY195592)。

1.2 水牛基因组DNA提取及PCR扩增测序

采用酚-氯仿法提取基因组DNA。采用雷初朝等[12]设计的水牛引物扩增线粒体DNA D-loop全序列,正链引物和反链引物分别为：F:5’-TAGTGCTAATACCAACGGCC-3’；R:5’-AGGCATTTTCAGTGCCTTGC-3’。PCR反应体系总体积为12.5 μL，扩增程序为：95 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，65 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将符合测序要求的PCR产物送至西安擎科泽西生物科技有限责任公司测序。

1.3 数据处理与统计分析方法

利用DNASTAR软件包中的SeqMan程序对序列进行人工校对，以确保所测序列的准确性；用DNASP5.0计算单倍型多样度、核苷酸多样度等；用分子进化遗传分析软件MEGA5.0构建Neighbor-Joining系统发育树。

2 结果与分析

2.1 mtDNA D-loop区遗传多样性

本研究分析的95头江河型水牛(尼里-拉菲水牛45头，摩拉水牛50头)mtDNA D-loop全序列长度在910～918 bp之间，这种长度变化主要是由于存在插入缺失而导致的。尼里-拉菲水牛和摩拉水牛mtDNA D-loop全序列由A、T、G、C四种碱基组成，其中A碱基含量最高(31.2%)，其次为T(28.5%)和C(25.5%)，G碱基含量最低，仅为14.8%。A+T的平均含量为59.7%，G+C的平均含量为40.3%，A+T的平均含量明显高于G+C，表现出碱基的偏好性。

对这95头水牛mtDNA D-loop全序列进行比对，共检测到112个变异位点，包括105个转换，7个颠换。这112个变异位点定义42种单倍型(图1)，其中，有16个单倍型(共包含21个体)属于沼泽型支系，有26个单倍型(包含74个体)属于江河型支系。尼里-拉菲水牛单倍型多样度(Hd±SD)为0.932±0.020，核苷酸多样度(Pi±SD)为0.0258±0.0045，平均核苷酸差异(k)为23.377；摩拉水牛单倍型多样度(Hd±SD)为0.958±0.016，核苷酸多样度(Pi±SD)为0.0303±0.0041，平均核苷酸差异(k)为26.86。由于尼里-拉菲水牛、摩拉水牛均为典型的江河型水牛，因此，去掉这两个水牛品种中检测到的属于沼泽型水牛个体，对其单倍型多样度(Hd±SD)、核苷酸多样度(Pi±SD)、平均核苷酸差异(k)进行统计，结果显示，尼里-拉菲水牛单倍型多样度(Hd±SD)为0.929±0.017，核苷酸多样度(Pi± SD)为0.0084±0.0013，平均核苷酸差异(k)为7.67；摩拉水牛单倍型多样度(Hd±SD)为0.934±0.027，核苷酸多样度(Pi±SD)为0.0064±0.0009，平均核苷酸差异(k)为5.69。

图1 尼里-拉菲水牛和摩拉水牛mtDNA D-loop单倍型的多态位点

2.2 NJ系统发育树

利用MEGA5.0软件对95头尼里-拉菲水牛和摩拉水牛mtDNA D-loop序列组成的42个单倍型进行系统发育分析，以已发表的已知支系的水牛序列(R1、R2、R3、SA、SB)作为参考，以家牛序列作为外群，构建水牛的NJ系统发育树。从图2可以看出，NJ系统发育树将水牛分为江河型水牛和沼泽型水牛两大支系。江河型水牛包含3个支系：R1、R2、R3，沼泽型水牛包含SA和SB 2个支系。

3 讨论

本文共分析了45头尼里-拉菲水牛和50头摩拉水牛的mtDNA D-loop区全序列，其4种碱基的含量分别为：A(31.2%)、T(28.5%)、C(25.5%)、G(14.8%)，表现出碱基的偏好性，这是一般多细胞动物mtDNA的显著特征[13]。A+T平均含量为59.7%，G+C的平均含量为40.3%，A+T的平均含量明显高于G+C，在绵羊[14]、山羊[15]、牦牛[16]、猪[17]、鸡[18]等的研究结果也表明，mtDNA D-loop区的A+T含量高于G+C含量，说明动物 mtDNA D-loop区的核苷酸含量在物种间有一定的相似性。

NJ系统发育树的结果显示，水牛分为江河型水牛和沼泽型水牛两大支系(图2)。江河型水牛支系包含3个支系26个单倍型74个个体，占水牛样本的77.9%(74/95)，其中，R1支系包括21个单倍型，代表64个个体，占67.37%；R2支系包括3个单倍型，代表3个个体，占3.16%；R3支系包括2个单倍型，代表7个个体，占7.37%。沼泽型水牛支系包含16个单倍型21个个体, 占水牛样本的22.1%(21/95)，其中SA支系包括11个单倍型，共15个个体，占15.79%；SB支系包含5个单倍型，共6个个体，占6.32%。所有21个沼泽型水牛mtDNA均来自本研究所采集的52个水牛样本，占所采集样本的40.38%，说明在广西南宁采集的52个尼里-拉菲水牛和摩拉水牛样本中，从外貌上看，纯种的尼里-拉菲水牛和摩拉水牛，与中国沼泽型水牛杂交后代已经很难鉴定，引入广西南宁的尼里-拉菲水牛和摩拉水牛与中国的沼泽型水牛存在广泛的血缘混杂现象。

图2 尼里-拉菲水牛和摩拉水牛 mtDNA D-loop单倍型的NJ树

尼里-拉菲水牛和摩拉水牛是世界上优良的江河型水牛品种，分别于1974、1957年引入我国，主要用于改善当地沼泽型水牛的产奶性能。而本研究在这两个水牛品种中均检测到沼泽型水牛的mtDNA支系，这是由于这两种水牛引入我国后，与当地的沼泽型水牛杂交导致的。单倍型多样度(Hd)和核苷酸多样度(Pi)是衡量一个群体mtDNA 变异程度的重要指标[19]，单倍型多样度和核苷酸多样度的值越大，说明群体的遗传多样性越丰富，反之，则说明群体的遗传多样性越缺乏。去掉属于沼泽型水牛支系的个体后，计算尼里-拉菲水牛和摩拉水牛的遗传参数，结果表明摩拉水牛的遗传多样性(Hd: 0.934±0.027)与尼里-拉菲水牛的遗传多样性(Hd: 0.929±0.017)都很丰富，说明引入中国的尼里-拉菲水牛和摩拉水牛的遗传来源比较广泛。