马铃薯 StMKK1基因RNAi干扰载体的构建及遗传转化

陈小康,李芳芳,王文斌,单卫星,杜 羽

(1.西北农林科技大学 园艺学院，陕西杨凌 712100；2.西北农林科技大学 农学院，陕西杨凌 712100)

马铃薯(SolanumtuberosumL.)是全球第四大重要粮食作物，同时在中国也是重要的蔬菜作物[1]。其营养价值高、适应性强、产量大，在人类生活中发挥着非常重要的作用，但是生物和非生物胁迫对马铃薯造成的损失仍然不容忽视。随着中国市场对马铃薯的需求不断增加，马铃薯产量的提升、农艺性状的改良以及优质品种的选育已成为马铃薯产业的战略性目标。然而，由于栽培马铃薯属于部分异源四倍体，杂合性高，利用常规杂交育种手段很难在较短时间内育成优良品种，近年来人们试图用基因工程技术对马铃薯品种进行农艺性状改良。目前四倍体和二倍体的马铃薯遗传转化体系不断被优化，但是关于马铃薯的遗传转化仍然存在基因依赖性问题[2-3]，对马铃薯遗传转化体系的改良和优化仍然是基因工程的重要技术改革。马铃薯遗传转化的改良和优化包括载体的选择和转化方法的优化，载体的选择取决于基因的功能，一般对于基因功能的验证包括过表达和基因沉默，本研究主要利用RNAi载体进行基因沉默，并获得一种高效的马铃薯遗传转化体系。目前，在作物中借助RNAi载体并结合遗传转化验证基因功能的报道有很多，例如李奇科等[4]构建了以PVY的CP为靶标的RNAi表达载体pROKY300，实现了马铃薯Y病毒CP基因在烟草中的沉默；安然等[5]利用RNAi表达载体pCEI-PFR，通过沉默马铃薯Sgt1-3基因来减少块茎糖苷生物碱积累；水稻抗旱基因OsbHLH120RNAi干扰载体的构建及遗传转化为进一步研究OsbHLH120在水稻抗旱过程中的作用奠定基础[6]。关于利用RNAi载体在马铃薯中的运用也有报道，如沉默马铃薯周皮层中StKCS6基因导致木栓质和蜡化合物的链长减少，同时增强表皮蒸腾作用；利用RNAi技术沉默马铃薯中的PVS基因，可以减少植物抗毒素的生成从而促进致病疫霉菌的侵染；RNAi介导的内源性Vlnv基因沉默可稳定降低马铃薯冷诱导产生的甜味[7-9]。对马铃薯作物而言，目前发掘实用且高效的RNAi沉默系统和改良遗传转化体系仍然具有重要意义。

RNA沉默(RNA interference，RNAi)是指生物体内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的细胞内mRNA被特异性降解，导致靶标基因被沉默，从而产生相应的功能表型的缺失现象[10]。RNAi技术在植物体内应用广泛，其原理为：将构建的RNAi植物表达载体导入植物体内，形成转录产物dsRNA(double stranded RNA，dsRNA)，然后dsRNA被植物体内的内切核酸酶Dicer切割成由正义和反义序列组成的，大小为21～25nt的干扰性小dsRNA(small interfering RNA, siRNA)，由siRNAs中的反义链指导形成RNA介导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)会特异性降解与siRNA同源的靶标mRNA，从而实现基因沉默[11]。

在植物中，MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)级联途径与生物及非生物胁迫响应、细胞分化和发育以及激素反应密切相关。MAPK 信号转导由 MAPK 级联反应逐级传递，在感受刺激后，上游的 MAPKKK 首先被磷酸化并特异激活 MAPKK，MAPKK 被激活后，紧接着磷酸化并激活下游的 MAPK，MAPK 被激活后可以磷酸化下游特定的转录因子或相关蛋白，并调节各类应答基因表达[12]。目前在植物中对于 MAPK 的研究报道较多，例如，AtMEKK1在水杨酸介导的防御反应中和活性氧稳态的调节过程中发挥重要作用[13]，拟南芥 MKK1蛋白信号通路调节应答效应子的基因表达，并在病原体防御中发挥重要作用[14]。拟南芥mkk2突变体植株对盐害的耐受性减弱，反之，过表达 MKK2的转基因植株对盐害的耐受性增加，表明拟南芥MKK2介导植物对冷害和盐害的胁迫响应[15]。番茄SlMKK2和SlMKK4正调控番茄对灰葡萄孢的免疫反应[16]。棉花GhMKK1通过降低PR基因的表达水平负调控棉花对青枯菌的抗性[17]。目前关于MKK1基因在拟南芥、番茄、棉花、水稻、玉米作物中的作用均有报道[14-19]，但在马铃薯中还未报道，MKK1作为 MAPK 级联反应的中间核心成员，在植物生长发育以及植物免疫调节中发挥着非常重要的作用。本研究通过克隆AtMKK1在马铃薯中的同源基因StMKK1，选定StMKK1保守且特异的靶序列，利用 RNA干扰技术，构建由 CaMV35S 启动子驱动的内含“正向StMKK1靶标片段-pdk intron-反向StMKK1靶标片段”结构的 RNAi 植物表达载体，利用根癌农杆菌将其转入马铃薯品种 Desiree 中，从而获得沉默StMKK1基因的马铃薯转基因植株。以期为马铃薯遗传转化体系优化和技术改良提供新的思路和方法，同时为研究StMKK1在马铃薯生长发育和免疫调节中可能发挥的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

四倍体马铃薯栽培品种Desiree来自西北农林科技大学，组培苗于西北农林科技大学园艺学院组培间培养，MS30培养基配方为： 4.43 g·L-1MS(粉末购自美国Phytotech公司)+30 g·L-1蔗糖+8 g·L-1琼脂，培养条件为23 ℃ 16 h光照培养，光照度3 000 lx，16 ℃ 8 h黑暗培养。取苗龄大约5～7周生长健壮的无菌苗用于试验。试验所用激素：2, 4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)和激动素(Kinetine)均购自Phytotech公司，卡那霉素(Kanamycine)、万古霉素(Vancomycine)和塞胞霉素(Cefotaxime)均购自索莱宝公司，萘乙酸(NAA)、6-苄基嘌呤(6-BA)、反式玉米素(trans-Zeatin-riboside)均购自Sigma公司。R3B培养基配方为：4.43 g·L-1MS+30 g·L-1蔗糖，pH调至5.8后用ddH2O定容，最后加入8 g·L-1Agar，121 ℃高压灭菌30 min，待稍冷却后加入2.0 mg·L-1NAA和1.0 mg·L-16-BA；PACM液体培养基配方为：4.43 g·L-1MS+30 g·L-1蔗糖+2.0 g·L-1水解酪蛋白， pH调至6.5后用ddH2O定容，121 ℃高压灭菌30 min，待稍冷却后加入0.5 mg·L-1激动素和1 mg·L-12, 4-D；Zcvk固体培养基配方为： 4.43 g·L-1MS+20 g·L-1蔗糖，调pH至5.8后加入8 g·L-1Agar，121 ℃高压灭菌30 min，冷却后加入100 mg·L-1卡那霉素、200 mg·L-1的塞胞霉素(Cefotaxime)、200 mg·L-1万古霉素(Vancomycine)以及1.0 mg·L-1的反氏玉米素。500 mL LB培养基配方为： Trptone 5 g，yeast extract 2.5 g，NaCl 5 g，Agar 3.8 g(液体培养基不加琼脂)，用ddH2O 定容，高压灭菌后使用。

所用高保真酶Fast pfu DNA polymerase、DNA聚合酶EasyTaqDNA Polymerase、连接酶T4DNA Ligase、限制性内切酶(promega)：EcoRI、KpnⅠ、XbaⅠ、HindⅢ、XhoⅠ、NotⅠ等。抗生素：盐酸壮观霉素、利福平霉素、庆大霉素、卡那霉素。琼脂糖、hydragreen无毒核酸染料、DNA loading Buffer、DNA marker Ⅲ(购自天根生化科技有限公司)。PCR仪、电泳仪、化学发光成像系统(BIO-RAD)、蓝光仪(TGreen Transilluminator Plus)电穿孔仪等。

试验所用农杆菌的菌株为GV3101，大肠杆菌DH5α，所用载体为PKANNIBAL和植物表达载体pART27，均来自旱区作物逆境生物学国家重点实验室。

1.2 方 法

1.2.1 RNAi载体构建 根据 National Center for Biotechnology Information(NCBI)和茄科数据库(https://solgenomics.net/)上公布的StMKK1序列信息，其GeneBank号为(XM_006353485.2)，利用 Bioedit和DNAMAN 6.0 软件比对StMKK1与其他物种的保守区段，确定特异靶标序列，并利用 primer 5.0 软件设计来自正向靶标序列的特异性引物StMKK1RNAi1EcoRI-F和StMKK1RNAi1KpnⅠ-R以及来自反向靶标序列的特异性引物StMKK1RNAi1XbaⅠ-F和StMKK1RNAi1HindⅢ-R，引物序列见表 1。载体构建部分参照李奇科等[4]的方法，以 Desiree 的 cDNA 为模板对正反向靶标序列进行克隆。反应程序： 95 ℃预变性 2 min；95 ℃变性 20 s，52 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 20 s，循环 35 次。在琼脂糖凝胶中检测，135 V恒压30 min 电泳，使用化学发光成像系统(BIO-RAD)拍照，利用胶回收试剂盒回收目的基因片段。以旱区作物逆境生物学国家重点实验室已有的通过NotⅠ酶切位点连接的 PKANNIBAL和 pART27 双元重组载体 35s-pART27 为基础，将质粒 35s-pART27 进行HindⅢ和XbaⅠ双酶切反应，与被HindⅢ 和XbaⅠ 双酶切的StMKK1的反向靶标序列进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞 DH5α，得到含有反向片段的重组克隆载体，测序正确后，命名为 35s-StMKK1R-pART27。然后对 35s-StMKK1R-pART27 进行EcoRI和KpnⅠ 双酶切反应，与同样进行EcoRI 和KpnⅠ 双酶切的StMKK1的正向靶标序列进行连接，然后转化大肠杆菌，最终得到反向重复序列的重组 RNAi 表达载体，测序正确后命名为35s-StMKK1-pART27-RNAi，然后将质粒转化到 GV3101 的农杆菌菌株中。

1.2.2 农杆菌介导的马铃薯遗传转化 农杆菌的活化：取出-80 ℃冰箱冻存的含有质粒的GV3101农杆菌菌株，在含有Spec(壮观霉素)、Gen(庆大霉素)和Rif(利福平霉素)抗性的LB平板上划线；挑取菌落到2 mL液体LB(含Spec、Gen和Rif)，在水平摇床上200 r/min 28 ℃过夜培养。待OD达到0.5后收集菌液，利用离心机2 500 g离心10 min，加入与原菌液等体积的LB重悬菌体，得到细菌转化液。提前24 h用手术刀切2～5 mm马铃薯茎段作为外植体，将其转移到R3B培养基中，之后在培养皿中加入2 张无菌滤纸以及2 mL的液体PACM进行预培养(培养条件为23 ℃， 16 h光照培养，光照度3 000 lx， 16 ℃ 8 h黑暗培养)，然后将外植体转移到细菌转化液中，浸泡5～10 min后用无菌滤纸干燥，然后将其放回新的R3B培养基中，用封口膜封口，初步诱导愈伤组织，黑暗培养48 h后，将其转到Zcvk培养基中培养，诱导愈伤组织和芽分化。培养半个月后，更换新的Zcvk培养基，直到获得转基因植株。当诱导出芽后，将其转移到带有卡那抗性的MS30培养基中进行筛选鉴定。愈伤组织诱导率=形成愈伤的外植体数/外植体总数×100%，芽诱导率=形成芽的愈伤数/形成愈伤的外植体数×100%，转化率=形成芽的愈伤数/外植体总数×100%。

1.2.3 转基因植株PCR检测 参照Fan等[20]的方法，提取马铃薯拟转化植株的基因组DNA。流程为：取叶片组织0.2 g，在液氮下磨碎至粉末状，用干净的药勺转移粉末到2 mL离心管，加入800 μL提前预热的CTAB buffer。混匀后放置65 ℃水浴中保温30～40 min，并不时轻轻摇动试管。冷却至室温后，加入约640 μL Tris-饱和酚(pH 8.0，含体积分数为1%的2-巯基乙醇)，颠倒混匀，室温静置10 min。加入160 μL氯仿，充分混匀后置于冰上5 min，然后12 000 g 4 ℃离心15 min，转移上清至新的离心管(约1 mL)，紧接着加入640 μL的异丙醇，混匀，在-20 ℃沉淀 1 h以上，然后室温12 000 g离心15 min，回收DNA沉淀。用体积分数为80%乙醇清洗DNA，室温12 000 g离心5 min，弃去上清液，再次离心10 s，用枪头移去残留液后，置超净工作台中干燥约2 min，将DNA溶于20 μL ddH2O。取1 μL DNA作为模板进行PCR 检测，并以特异引物StMKK1RNAi1KpnⅠ-R：5′-GGGGTACCTAGC- TCAGTAAGTGTTGCCAATG-3′和pKAN-F：5′-CAATCCCACTATC CTTCGCA-3′进行PCR 扩增，引物由北京奥科公司合成。PCR反应程序为：94 ℃预变性8 min；94 ℃变性30 s，52 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，循环30次。所用体系为： 0.5 μg·μL-1DNA 模板1 μL，10×EasyTaqbuffer 2.5 μL，引物各0.5 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL， EasyTaqDNA polymerase 0.2 μL ，用ddH2O定容至总体积25 μL。预期扩增片段大小为302 bp左右，以未转化Desiree植株为阴性对照。扩增产物使用10 g·L-1琼脂糖凝胶进行电泳。

1.2.4 转基因植株qRT-PCR检测 植物总RNA提取完全参照Plant RNA Kit试剂盒说明书(货号R6827-01)进行，完全按照TaKara公司反转录试剂盒(PrimeScriptTMRT regent kit，货号RR047A)说明书进行反转录。完全参照FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)(货号为No.04913914001)说明书，以25 μL体系在Life Technologies公司生产的Q5实时定量PCR仪上进行反应和检测。使用特异引物StMKK1-transgeneqpcr-F：5′-TTGCTAATCAATCACA-GAGGTG-3′和StMKK1-transgeneqpcr-R：5′-TGTCGCTTTTGTAATCATAGGC-3′。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2 结果与分析

2.1 35s- StMKK1-pART27-RNAi载体的获得

利用StMKK1的正反向靶标序列的特异性引物分别扩增得到大小为302 bp的正向干扰片段和反向干扰片段(图1-A)，将载体重组质粒35s-pART27进行XbaⅠ和HindⅢ双酶切反应，与空质粒相比，酶切后的质粒条带更大，证明载体已被线性化(图1-B)，酶切后的35s-pART27与反向干扰片段连接并转化，菌落PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，得到300 bp左右的目标条带，测序验证后，获得含有反向干扰片段的重组克隆载体，命名为35s-StMKK1R-pART27(图1-C)，然后用EcoRI和KpnⅠ分别酶切正向干扰片段和35s-StMKK1R-pART27载体(图1-D)并连接，进行菌落PCR检测，结果显示在琼脂糖凝胶中出现300 bp左右大小的条带(图1-E)，提取重组表达载体送北京奥科公司测序，测序结果完全正确，得到含有反向重复序列的重组RNAi植物表达载体35s-StMKK1-pART27-RNAi。并创建35s-StMKK1-pART27-RNAi载体的结构简图(图2)。

2.2 建立基于根癌农杆菌侵染马铃薯茎段的遗传转化体系

以马铃薯茎段作为外植体，在含有35s-StMKK1-pART27-RNAi质粒的细菌转化液中，浸泡5～10 min(图3-A)，完成侵染后用无菌滤纸进行外植体干燥，将其放回R3B培养基中用封口膜封口，黑暗培养48 h后，将其转移到Zcvk培养基中(图3-B)培养，每半月更换Zcvk培养基，直到获得转基因植株(图3-C～图3-F)。当诱导出芽后，将其转到带有卡那抗性的MS30培养基中进行筛选鉴定，经统计共切了90个茎段外植体，诱导出愈伤约为72个，分化不定芽约为53个，所用体系的愈伤诱导率可达80%，芽分化率可达74%。

2.3 马铃薯 StMKK1转基因植株的鉴定

2.3.1 马铃薯转基因植株的PCR检测 随机挑选经过卡那抗生素筛选的17株马铃薯转化植株提取基因组DNA，以此为模板用pKAN-F和StMKK1RNAi1KpnⅠ-R引物进行PCR检测，以未转化的Desiree植株作为对照，结果显示有16株转基因苗扩增出302 bp左右的目标条带，对照Desiree没有扩增出目标条带。初步证明StMKK1靶序列已整合到马铃薯的基因组中(图4)。

A.目的基因的扩增，1～2. StMKK1正向和反向干扰序列扩增片段；B. 35s-pART27重组质粒的HindⅢ和XbaⅠ酶切检测，1. 重组质粒35s-pART27，2～3.35s-pART27质粒被HindⅢ和XbaⅠ双酶切后的条带；C.连接反向干扰片段载体的菌落PCR检测，1～5. 挑选的5个候选菌落；D.重组35s- StMKK1R-pART27质粒的EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切检测，1.重组 StMKK1反向片段质粒35s- StMKK1R-pART27，2～3.35s- StMKK1R-pART27质粒被EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切后的条带；E.连接正向干扰片段的菌落PCR检测，1～8.挑选的8个候选菌落； M.DNA marker Ⅲ

CaMV35S.35s启动子；Noster.终止子；PDK Intron.丙酮酸磷酸双激酶内含子；MCS.多克隆酶切位点；StMKK1F.StMKK1的正向干扰片段；StMKK1R.StMKK1的反向干扰片段

2.3.2 马铃薯转基因植株的qRT-PCR检测 将PCR鉴定结果为阳性的株系提取总RNA，反转录后以此为模板，对外源基因表达情况进行分析。以马铃薯的Stactin-7like基因(XM_006350963)作为内参基因，利用实时荧光定量PCR技术检测马铃薯转化植株叶片中StMKK1基因的表达量，结果表明：与未转化的Desiree相比，StMKK1基因在转基因植株(RNAi-2-RNAi12)中的表达量均显著下降(其中RNAi-9植株除外)，降幅达到92%以上，与未转化Desiree相比，RNAi-9植株中StMKK1基因的表达量没有显著差异，充分证明转基因植株中StMKK1基因的表达基本都受到一定程度的干扰(图5)。

A.马铃薯茎段刚接种；B.外植体转移到Zcvk培养基诱导愈伤组织；C.转移到Zcvk培养基诱导出不定芽；D.将芽转移到MS30培养基诱根；E.生根；F.植株再生

M.DNA markerⅢ；CK.Desiree；1～20.转基因植株的PCR扩增条带

3 讨 论

RNAi主要过程是dsRNA被内切核酸酶切割成21～25 nt的干扰性小RNA(siRNA)，同时由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA分子。一般所用RNAi载体的基本构成就是在强组成型启动子下游插入反向重复片段的重组双元载体，是导致RNA沉默的基本结构，所建成的35s-StMKK1-pART27-RNAi就是采用在基因组中产生反向重复序列的转录产物，实现沉默StMKK1基因的目的。本研究利用pKANNIBAL载体两个多克隆位点间的间隔序列构建尾尾相连而导致基因产生自我互补的hpRNA(分子dSRNA)结构。RNAi沉默载体中反向重复序列结构中的间隔序列可以是任一段核酸，据相关试验证明[21]，间隔序列为内含子的反向重复序列，具有良好的稳定性，更有利于dsRNA的产生和RNA沉默的诱导。

StMKK1在野生型Desiree和8个独立的转基因植株中的表达水平

近些年来，随着CRISPR-Cas9定点基因编辑技术在植物中的应用，由于其可以进行基因敲除(单个基因敲除，多基因敲除以及大片段缺失)以及精确的碱基编辑，转录激活和转录抑制，逐渐成为人们使用的热门技术[22]。在拟南芥、小麦、高粱、烟草、水稻、玉米、苔藓植物以及地钱等植物中实现了定点基因组编辑的成功应用[23]。但是在马铃薯上应用的报道较少，一方面可能是由于马铃薯是四倍体，基因组信息复杂，数据库信息不完整可能容易脱靶，另外一方面就是马铃薯CRISPR-Cas9体系仍然需要改进和优化，使其具有广谱性。目前很多学者在马铃薯上进行遗传转化仍然使用RNAi干扰技术。本研究利用RNAi干扰技术对StMKK1基因在马铃薯中进行沉默，获得了高达92%以上的沉默效率，故所使用的RNAi载体具有高程度的干扰效率。

关于马铃薯遗传转化体系的报道有很多，如在Desiree中稳定表达StMYB44，通过抑制StPHO1的表达来负调控马铃薯中的Pi转运[24]。在马铃薯中过表达转化PiSIF3可以显著促进致病疫霉的侵染[25]。辛翠花等[26]以Desiree的叶片和茎段为外植体，获得了具有抗晚疫病功能的马铃薯转基因植株。使用artificial microRNA技术在马铃薯中沉默CBP80/ABH1基因，提高马铃薯的抗旱性[27]。但是关于马铃薯遗传转化体系，不同的实验室体系有差异，其转化条件也不一样。即使同一材料的遗传转化方法也是有差异的，一般认为马铃薯的遗传转化效率受植物的基因型、农杆菌菌株类型、外植体类型、激素配比、侵染时间、共培养时间、农杆菌菌液浓度等因素的影响。辛翠花等[26]研究发现，以马铃薯叶片作为外植体，愈伤诱导率为60%，芽分化率为50%，遗传转化效率为30%，明显低于本研究以茎段作为外植体所获得的80%愈伤诱导率和74%的芽分化率以及59%的遗传转化效率。而裴瑞芳等[28]以马铃薯试管薯作为侵染材料，同样获得马铃薯的转化植株，证实马铃薯的多个组织均可以被用作侵染材料从而获得转化植株。安然等[5]以马铃薯品种‘庄薯3号’和Favorita 组培苗作为侵染材料，以茎段作为外植体，利用农杆菌介导的方法，所用激素与本研究大致相同，获得了60.23%的芽分化率，而本研究以四倍体栽培种Desiree组培苗作为侵染材料，获得了74%的芽分化率，但获得转化植株从宏观角度显示马铃薯品种不同转化效率也是不一致的。本研究利用常规的农杆菌介导方法，以茎段作为外植体，农杆菌的侵染浓度为OD=0.5，侵染时间为7 min，PACM培养基用来辅助侵染和预培养，利用R3B培养基诱导愈伤组织，Zcvk培养基诱导芽分化。转化周期为90 d左右，经统计诱导出愈伤约为72个，分化不定芽约为53个，所用体系的愈伤诱导率可达80%，芽分化率可达74%，转化率可达59%。所以本研究所用的马铃薯转化体系效率是较高的。

本研究转化了一个马铃薯丝裂原活化蛋白激酶StMKK1，关于MKK蛋白在生物和非生物胁迫中的研究有很多，MAPKK可以被上游的促丝裂原活化蛋白质激酶激酶激酶(MAPKKK)磷酸化其保守区域中丝/苏氨酸残基从而激活MAPKK，同时也可以磷酸化下游MAPK第七和第八亚结构域之间的丝/苏氨酸和酪氨酸残基从而激活MAPK[29]，在植物生长发育和植物免疫调控过程中发挥着重要的作用。本研究通过农杆菌介导的遗传转化方法获得StMKK1的转基因植株，为后期解析其调控植物免疫机制奠定基础。

4 结 论

本研究以Desiree茎段作为外植体，构建融合StMKK1基因反向重复序列的RNAi表达载体，采用农杆菌侵染的遗传转化方法，获得了马铃薯丝裂原活化蛋白激酶StMKK1沉默的转基因马铃薯植株。qRT-PCR检测结果表明，在马铃薯转基因植株中，StMKK1基因表达量的降幅大于92%。研究结果为进一步研究StMKK1基因在马铃薯响应胁迫和信号转导中的作用奠定基础。