胆道恶性肿瘤的生物学特性

李博 曹坤 左石

胆道恶性肿瘤(以下简称胆道肿瘤)是一种起源于胆管上皮细胞，具有多层次异质性、侵袭性的肿瘤，其发病率在全世界范围内呈上升趋势[1]。根据起源部位的不同，主要分为肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)、肝门部胆管癌(perihilar cholangiocarcinoma,PCC)、远端胆管癌(distal cholangiocarcinoma,DCC)及胆囊癌。由于临床表现较晚，缺乏特异性体征和症状，胆道肿瘤患者通常在晚期确诊，导致治疗选择有限且预后不尽人意，即使早期经手术切除治疗后，局部复发率也较高，总体5年生存率约30%[2]。化疗可以提高晚期胆道肿瘤患者的存活率，是目前不能手术切除患者的首选治疗措施，一线化疗是吉西他滨联合铂类药物，但整体生存响应率较低[3]。因此加入对胆道肿瘤生物学特征的研究在疾病早期筛查、早期诊断、早期治疗等方面具有至关重要的临床价值。随着近年来基因组图谱和生物信息学技术的显著进步，综合基因组图谱研究不仅发现肝内外胆管癌的基因组异质性，还揭示了具有复杂相互作用的多个复发驱动因素的改变，使人们对胆道肿瘤的生物学特性有了更深层次的认识。本文将从遗传学、表观遗传学、蛋白组学等相关方面对胆管癌生物学特性进行综述。

一、基因组及表观基因组与胆道肿瘤

下一代测序技术(next-generation sequencing,NGS)针对全基因组的分析发现，胆道肿瘤具有不同病因的基因突变、基因扩增、基因重排等生物信息。Jusakul等[4]对胆道肿瘤的全基因组和表观基因组分析，揭示了胆道肿瘤的四个亚型，提出除解剖位置外,分子亚型可进一步提供胆道肿瘤的临床病理学特性及分子生物学信息，其中亚型1/2富含ERBB2扩增和TP53突变，亚型3/4与BAP1和IDH1-2高突变相关，基于驱动基因与病因及临床病理特征之间的联系，发现仅亚型1/2与肝吸虫感染有关。值得注意的是，相关研究通过突变谱进行分类，发现这种基因突变分类(IDH1-2/BAP1/PBRM1与KRAS/TP53)在单变量和多变量分析中都是患者生存率的有力预测因子[5]。此前研究显示，TP53突变的ICC患者HBsAg多为阳性，而KRAS突变仅在HBsAg阴性的ICC患者中检测到[6]。最近两项基于多组学数据研究评估了胆道肿瘤的相关驱动因素，一项为Maeve A等的研究[7]，该研究通过NGS分析158例ICC病例发现最常见的改变基因是IDH1(30%)、ARID1A(23%)、BAP1(20%)、TP53(20%)和FGFR2基因融合(14%)；另一项为Robert等人的研究[8]，他们分析了150例PCC病例，发现KRAS(36.7%)、TP53(34.7%)、ARID1A(14.0%)和Smad4(10.7%)四种基因是最常见的基因突变。

二、表观遗传学与胆道肿瘤

肿瘤细胞和正常细胞在表观遗传特征上的差异是显著的，通常与肿瘤抑制基因表达的丧失和癌基因功能的获得有关，表观遗传信息通过各种生化修饰进行跨代传递，包括DNA甲基化、组蛋白翻译后修饰、染色质重塑及非编码RNA调控等。

1.DNA甲基化与胆道肿瘤:DNA甲基化是人类癌症研究最广泛的表观遗传学改变。在生物系统中，由DNA甲基转移酶催化，与CpG甲基化结合蛋白相互作用，从而调节基因表达，维持或改变DNA的结构。哺乳动物的DNA甲基化通常发生在CpG岛，全基因组研究表明，近60%的CpG岛位于人类基因的启动子中。DNA甲基化水平和模式的改变，如CpG岛局部的高甲基化和基因组DNA低甲基化状态与细胞周期、凋亡、增殖及肿瘤细胞发生发展相关[9]。SOX17启动子在人胆管癌组织中高甲基化早有报道，另一项实验通过研究SOX17在胆管癌中的表达及其潜在的表观遗传调控，发现SOX17在胆管癌组织和细胞系中表达下调，并证实了SOX17启动子在胆道肿瘤组织中存在高甲基化，并进一步研究发现其表达与甲基化水平呈负相关[10]。既往的研究表明OPCML的高甲基化在胆道肿瘤组织中非常频繁(72%)，而在癌旁组织中则不常见。最近，Wiphawan等[11]采用甲基化敏感高分辨熔融技术对胆道肿瘤患者血清游离DNA中OPCML、HOXA9基因甲基化进行定量分析，发现OPCML和HOXD9两个甲基化基因联合检测的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为62.50%、100%、100%和72.72%。另一项研究中，通过对71例胆道肿瘤患者的肿瘤标本和对照的癌旁组织进行分析，发现以SHOX2和SEPT9甲基化作为标记物，区分胆道肿瘤和非胆道肿瘤的敏感性为45%，特异性为99%，并认为SHOX2和SEPT9启动子甲基化可作为支持临床标本诊断、发现和治疗的生物标志物[12]。

2.组蛋白修饰和胆道肿瘤:染色质组织的基本单位是核小体，它由一个组蛋白八聚体复合物组成，周围环绕着DNA。通过特殊的表观遗传酶对组蛋白进行翻译后修饰，促进DNA修复和维持基因组的稳定。组蛋白的各种修饰，如甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化等，都会改变二级DNA结构，从而改变基因表达。核心组蛋白N端的乙酰化受到组蛋白乙酰转移酶和组蛋白脱乙酰化酶(HDACs)的严格控制，HDACs去除组蛋白赖氨酸残基上的乙酰基，导致染色质凝聚，抑制转录。HDAC介导的表观遗传学改变在胆道肿瘤发病机制中的重要性已被报道[13]。相关研究发现，HDACs2、HDACs3在胆道肿瘤组织中表达上调，且HDAC2和/或HDAC3高表达的患者预后较差[14]。另一项研究报道，HDAC3在胆道肿瘤中的表达存在差异，且与临床病理因素相关，高水平的HDAC3在诱导胆道肿瘤细胞增殖的同时也抑制了癌细胞的凋亡[15]。大量研究表明，HDACs可通过多种途径在致癌过程中发挥重要作用，HDACs抑制剂也可通过多种机制影响胆道肿瘤发生发展，发挥抗癌作用，深入探讨两者之间的分子机制将可能为胆道肿瘤治疗靶点预测提供新的思路[16]。

3.非编码RNA与胆道肿瘤:高通量技术已经使广泛的基因组、外显子组和转录组测序成为可能，也使得非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)的重要性得到证实，ncRNA在细胞分化、增殖、迁移、细胞周期调控和凋亡等多种基本细胞过程中发挥着重要作用。其中内源性非编码单链RNA(micro RNA,miRNA)是包括增值和凋亡在内的各种生物过程的关键调节因子，在胆道肿瘤致癌状态的启动、维持和发展中起着至关重要的作用[17]。越来越多的证据表明，长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在胆道肿瘤的发生发展中起着重要作用,异常表达的lncRNA能与DNA、RNA、蛋白质相互作用，可促进胆道肿瘤的恶性表型并预测胆道肿瘤细胞的不良预后，lncRNA可能成为是胆道肿瘤最具潜力的生物标志物或干预靶点[18]。相关研究通过检测56例人胆道肿瘤组织及相应癌旁组织中LncRNA AFAP1-AS1的表达水平，发现胆道肿瘤组织中AFAP1-AS1表达增加，且AFAP1-AS1高表达患者总生存期较短，并认为AFAP1-AS1可作为胆道肿瘤一个新的潜在治疗靶点[19]。进一步研究发现，LncRNA ZEB1-AS1具有较高的敏感性和特异性，可作为胆道肿瘤患者预后不良的独立预测因子，ZEB1-AS1可通过结合miR-133b增加癌基因同源盒B8(HOXB8)的表达，从而促进肿瘤的增殖和侵袭[20]。大多数lncRNA除了充当内源竞争RNA(competing endogenous RNAs，ceRNA)的角色，可以调节相关的miRNA，也可直接作用于表观调节因子从而影响肿瘤的发生发展。因此对胆道肿瘤中ncRNA的深入研究不仅能促进对其分子和功能作用的理解，还有望发现新的肿瘤标志物和新的治疗策略。

三、蛋白组学与胆道肿瘤

蛋白组学指基因组表达的所有相应蛋白，即细胞、组织或机体全部蛋白质的存在及其活动形式，包括蛋白与蛋白相互作用、蛋白质的表达水平及翻译后的修饰等。蛋白质组学已经在发现胆道癌生物标志物及治疗靶标中得到验证，细胞、组织、胆汁、血清等均可成为胆道癌生物学特征研究对象的重要来源[16]。研究发现，与正常胆汁相比，胆管癌患者胆汁中共有63个蛋白质显著增加，其中，α-1抗胰蛋白酶阳性占70%[21]。另一项研究分析了胆道肿瘤和良性胆道疾病血清中的蛋白质差异，结果显示FAM19A5、MAGED4B、KIAA0321、RBAK和UPF3B在肿瘤和非肿瘤患者中表达存在显著差异，可作为区分胆道肿瘤和良性胆道疾病的新的生物标志物[22]。Le Faouder等通过非标记定量蛋白组学分析，发现ICC中，参与细胞黏附和运动(ITGA4、ITGA7、Rho GTPase)、细胞生长(TRAF3IP3)、凋亡抑制(BCL2)和血管生成(PDGFRb、VCAM1、PECAM1)相关的蛋白高表达[23]。PPP3CA作为钙调神经磷酸酶的一个催化亚基，已被证明与肿瘤细胞的发生发展有关，Zengwei等[24]应用定量蛋白质组学分析胆道肿瘤与癌旁组织的差异表达蛋白质，发现233个差异蛋白表达，其中PPP3CA是胆道肿瘤预后不良的一个新的独立因素。另一项研究采用同样的方法，分析了2株胆道肿瘤细胞系，发现TPD52和DNAJB1在胆道肿瘤细胞系、组织和胆汁标本中的表达水平升高，提示这些蛋白可能参与了肿瘤的发生发展，进一步研究还发现TPD52和DNAJB1的表达水平与胆道肿瘤患者的临床病例特征和预后密切相关[25]。

四、结语

胆道恶性肿瘤的发病分子机制十分复杂，诊断方面缺乏有效的生物标志物，包括生物靶向治疗在内的现有治疗方案难以取得令人满意的治疗效果。近年来，随着多组学技术在高通量筛选的应用使得胆道肿瘤在诊断、治疗、预后等相关的生物标记物研究得到广泛认识，也促进了胆道肿瘤相关分子机制的研究。研究发现不同的解剖亚型和临床亚型中存在不同的驱动基因异常，众多候选分子让科研人员进一步了解胆道肿瘤的生物学特性，但转化为临床实践仍需要很长一段时间，因此对肿瘤相关分子探索的同时，应及时有效地从多组学方向分析已有的研究成果，寻找更具特异性及敏感性的分子或分子组合并验证它们在胆道肿瘤诊断、治疗及预后中的潜在用途。此外，实现多领域、多学科的综合性研究将会为寻找有效地早期生物标志物提供广阔的前景。