高效液相色谱法同时检测安神补脑胶囊中2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷含量*

江 勋，彭婷婷，周 峰

（湖南省衡阳市市场监督检验检测中心，湖南 衡阳421001）

安神补脑胶囊是由鹿茸、制何首乌、淫羊藿、干姜、甘草、大枣经提取后加维生素B1组成的复方制剂，具有生精补髓、益气补血、健脑安神的功效，用于肾精不足、气血两亏所致失眠、健忘、头晕、神经衰弱等症[1]，临床应用广泛，疗效较好，且安全性好。全国仅有4家药品生产企业具备批准文号（分别为国家食品药品监督管理局 标 准YBZ15322009，YBZ02542009，YBZ06762009，YBZ08452009），但其质量标准不一，均以2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷的含量测定作为处方中制何首乌的质控指标。方中制何首乌和淫羊藿为君药。淫羊藿始载于《神农本草经》，具有补肾壮阳、强筋健骨、祛风除湿等功效，可用于增强免疫力、治疗骨质疏松、改善心肺功能[2-4]，约有55种，我国有45种[5]，其中4种收录于2015年版《中国药典（一部）》，分别为淫羊藿Epimedium BrevicornuMaxim、箭叶淫羊藿Epimedium Sagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim、柔毛淫羊藿Epimedium PubescensMaxim、朝鲜淫羊藿Epimedium KoreanumNakai的干燥叶，性辛、温，味甘，补肾阳，强筋骨，祛风湿[6]。不同品种、产地、采收季节的淫羊藿中的指标性功效成分淫羊藿苷含量差异较大[7-8]，可能导致不同厂家不同批次产品的疗效差异。为了能更有效地对安神补脑胶囊进行质量控制，本研究中把单一指标定量控制提高到同时控制2个指标成分的含量，建立同时测定安神补脑胶囊中2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷含量的高效液相色谱（HPLC）法[9]。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Shimadzu LC-20AT型液相色谱仪，SPD-M20A型检测器，均购自日本岛津公司；AE240S型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多集团公司，精度为十万分之一）；DK-615HT型超声波清洗仪（深圳市得康洗净电器有限公司，功率为360 W，频率为40 kHz）。

1.2 试药

2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷对照品（批号为110844-201814，纯度为91.0%），淫羊藿苷对照品（批号为110737-201516，纯度为94.2%），均购自中国食品药品检定研究院；安神补脑胶囊（江苏晨牌药业集团股份有限公司，批号分别为1804152，180523，1807092，1901072，1903082，1904012，1907122；江西南昌桑海制药有限责任公司，批号分别为181007，181209，190120，190247；亚宝药业集团股份有限公司，批号为190301）；乙腈（色谱纯，批号为N9CA1H），甲醇（色谱纯，批号为T3AG1H），均购自美国Honey Well公司；水为屈臣氏蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Shimadzu Shim-packVP-ODSC18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0～11 min时20%A，11～12 min时20%A～36%A，12～24 min时36%A，24～25 min时36%A～20%A，25～30 min时20%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：350 nm；柱温：35℃；进样量：10μL。理论板数按2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷峰计均不低于10 000。在此色谱条件下，2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷与其他组分均能达到基线分离，色谱图见图1。

2.2 溶液制备

取2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷251.84μg、淫羊藿苷74.52μg的混合对照品溶液。取样品0.25 g，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，密塞，称定质量，超声（功率为300 W，频率为40 kHz）处理30 min，取出，放冷，再称定质量，用稀乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按标准中的处方量及制备方法，分别制备不含制何首乌、淫羊藿的样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

阴性干扰试验：取2.2项下3种溶液，按拟订色谱条件进样测定。色谱图见图1。

线性关系考察：分别取对照品溶液适量，加甲醇稀释成含2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷16.79，33.58，67.16，134.32，167.90，201.47，251.84μg/mL和淫羊藿苷4.98，9.93，6.62，19.86，49.68，59.61，74.52μg/mL的系列溶液，按拟订色谱条件进样测定，分别以对照品溶液的质量浓度（X）为横坐标、色谱峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程。结果见表1。

定量限和检测限确定：精密量取对照品溶液，用甲醇依次稀释至由高到低的溶液，测得2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷的检测限（S/N=3）和定量限（S/N=10）。结果见表1。

图1高效液相色谱图

表1线性关系、定量限和检测限考察结果

精密度试验：精密吸取同一对照品溶液10μL，按拟订色谱条件连续进样5次。结果2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷色谱峰面积的RSD分别为0.47%和0.61%（n=5），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品（批号为1807092）适量，分别于配制后0，4，8，12，18，24 h时按拟订色谱条件进样测定。结果2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷色谱峰峰面积的RSD分别为0.41%和0.62%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

重复性试验：精密称取同一批（批号为1807092）样品6份，分别依法制备供试品溶液，进样测定。结果2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷峰面积的RSD分别为0.87%和0.95%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的同一批（批号为1807092）样品9份，分别精密加入2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷对照品适量，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，计算回收率。结果见表2。

表2加样回收试验结果（n=9）

2.4 样品含量测定

取样品约0.25 g，精密称定，依法制备供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液和样品溶液各20μL，注入液相色谱仪，平行测定2次，计算2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷含量。结果见表3。

表3安神补脑胶囊成分定量测定结果（mg/g，n=12）

3 讨论

3.1 测定波长选择

紫外吸收图谱显示，2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷最大吸收波长分别为320 nm[9]和270 nm[6]，但其色谱图中二者对应保留时间处均有干扰峰存在。试验表明，在350 nm波长处二者均有良好吸收，且相应保留时间处无杂质峰干扰，故选择350 nm作为测定波长[9]。

3.2 流动相选择

分别考察甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液的等度洗脱和梯度洗脱，结果仅乙腈-水梯度洗脱可以同时对2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷的分离都达到满意效果，且流动相本身干扰小，稳定、可靠，故选择乙腈-水梯度洗脱。

3.3 提取方法选择

2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷均在稀乙醇中有良好的溶解度，且提取效果佳，干扰少，故选择稀乙醇为提取溶剂。分别考察了提取时间为20，30，40 min时二者的含量，结果30 min的提取效果最佳。

3.4 样品分析

对收集到的12批不同厂家生产的样品进行检测，发现2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷含量较接近，但淫羊藿苷含量差异较大。考虑不同厂家的安神补脑胶囊功能指标成分含量差异可能与原药材质量差异及生产工艺有关，不同品种、产地、采收季节的淫羊藿中淫羊藿苷含量差异显著。目前，含量检测研究多采用单一成分测定的方法，耗时、低效。本试验中采用在同一色谱条件下同时测定2个指标成分的方法，操作简便，效率高，结果可靠，为提升本制剂的质量标准提供了可靠依据。

3.5 方法评价

2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷和淫羊藿苷分别为处方中制何首乌和淫羊藿2味君药的指标性功效成分，含量都较高，均为水溶性物质，溶出度好。前者具有调血脂、抗氧化、抗炎、提高学习记忆能力、保护神经细胞、保护血管上皮细胞等生物活性[10-11]；后者具有增强性腺功能、调节机体免疫、促进骨生长、延缓衰老，强心、降血压、抗心律失常、增加脑血流量，抑菌、抗病毒、抗炎、降血脂、抗肿瘤等多种作用[4]。以其二者作为指标成分，采用HPLC法进行质量控制，方法简便、准确，能更好地保证安神补脑胶囊的质量及疗效。