高效液相色谱法测定左金丸和左金胶囊中9种成分含量

宫玉婷，刘晓倩，陈雅然

（新疆维吾尔自治区阿克苏地区药品检验所，新疆 阿克苏843000）

左金丸出自朱丹溪《丹溪心法·火六》[1]，由黄连与吴茱萸按6∶1的配伍比例组方，两药相伍，一寒一热，辛开苦降，以苦降肝火为主，兼于辛开疏散火郁，对于肝经火郁、津液未伤者，用之甚为恰当[2]。可治疗脾胃功能失调、应激性胃溃疡、急性胃黏膜损伤等胃肠道引起的消化系统疾病[3-5]，加味其他中药可治疗慢性胃炎、消化性溃疡和胆汁反流性胃炎等胃肠道疾病[6-8]，效果佳且复发率低[10-11]。同时，左金丸对金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌等高度敏感，对大肠杆菌、痢疾杆菌等中度敏感[12]。陈懿[13]发现，左金丸能有效预防血管紧张素Ⅱ诱导的内皮炎症，其作用机制可能与NF-κB信号转导通路有关[14]。李冀等[15]用左金丸加味医治牙痛，服用3剂后齿龈肿消痛止[16]。黄连Coptis chinensisFranch.属毛茛科、黄连属多年生草本植物，为常用中药材。吴茱萸含有生物碱、黄酮类、香豆素、精油及其他成分，从吴茱萸中已分离鉴定出多种生物碱，主要有吲哚类、喹诺酮类、呋喃喹啉类和吖喧酮类生物碱，其中吴茱萸碱、去氢吴茱萸碱、吴茱萸次碱等[17-18]是主要化学成分；另外，吴茱萸中还包括苦味素类和挥发油类[19]。2015年版《中国药典（一部）》中左金丸和左金胶囊的质量控制方法之一是采用高效液相色谱（HPLC）法测定其盐酸小檗碱含量，但未对其他活性成分进行检测。本研究中采用HPLC法同时测定左金丸和左金胶囊中表小檗碱、盐酸小檗碱、去氢吴茱萸碱、黄连碱、柠檬苦素、盐酸巴马汀、吴茱萸碱、盐酸药根碱、吴茱萸次碱9种成分的含量，可为完善左金制剂的质量控制方法提供依据；同时应用仿生提取法来模拟胃肠道环境，观察不同比例配伍的黄连和吴茱萸药材中有效成分的溶出状况，为其临床使用配比提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LQ-A20002型电子天平（丹佛仪器北京有限公司，精度为0.000 1 g）；安捷伦1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；TG16-WS型台式高速离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；SHB-Ⅲ型循环水多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；KQ-500VDB型三频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率为800 W，频率为28/40 kHz）；800Y型高速多功能粉碎机（永康市柏欧五金制品有限公司）；QYC-200型恒温振荡器（上海福玛实验设备有限公司）。

图1高效液相色谱图

1.2 试药

盐酸小檗碱（批号为633-65-8，纯度≥98%），盐酸巴马汀（批号为10605-02-4，纯度≥98%），黄连碱（批号为3486-66-6，纯度≥98%），盐酸药根碱（批号为960383-96-4，纯度≥94%），吴茱萸碱（批号为518-17-2，纯度≥98%），吴茱萸次碱（批号为84-26-4，纯度≥98%），柠檬苦素（批号为1180-71-8，纯度≥98%），表小檗碱（批号为6873-09-2，纯度≥98%），均购自成都曼斯特生物科技有限公司；去氢吴茱萸碱（上海安奈德化学技术中心，批号为6588-15-3，纯度≥98%）；左金丸（市售，温州海鹤药业有限公司，湖北香连药业有限公司，批号分别为201906080，201911023）；左金胶囊（市售，温州海鹤药业有限公司，批号为201904120）；甲醇、乙腈，均为色谱纯，均购自美国Tedia“天地”公司；娃哈哈纯净水；盐酸、三乙胺、磷酸等其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenexluna C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：含0.1%磷酸和0.05%三乙胺（A）-乙腈（B）水溶液，梯度洗脱，0～30 min时85%A→82%A，15%B→18%B；30～44 min时82%A→40%A，18%B→60%B；44～50 min时40%A→35%A，60%B→15%B；50～60 min时85%A→15%B；检测波长：225 nm；柱温：25℃；流速：1.0 mL/min；进样量：10μL。

2.2 溶液制备

对照品溶液：分别取表小檗碱、盐酸药根碱、黄连碱、去氢吴茱萸碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱各2 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，分别加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得质量浓 度 为0.179，0.191，0.208，0.235，0.213，0.191，0.223，0.187，0.238 mg/mL的对照品溶液。精密量取上述溶液各100μL，混匀，即得混合对照品溶液。

供试品溶液：取左金丸（湖北、温州）10丸，称定质量，放入研钵中研细，取细粉约0.1 g，精密称定，置250 mL具塞锥形瓶中，加入80 mL甲醇-水-盐酸（80∶20∶1，V/V/V）混合溶液，称定质量，超声处理30 min，放至室温，补足减失的质量，吸取适量溶液，经0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液1，2。取左金胶囊，同法制备供试品溶液3。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：取混合对照品溶液适量，按拟订色谱条件进样10μL，记录色谱图，详见图1。结果去氢吴茱萸碱、表小檗碱、盐酸巴马汀、柠檬苦素、黄连碱、吴茱萸碱、盐酸药根碱、盐酸小檗碱、吴茱萸次碱的保留时间分别为24.51，21.44，34.64，45.33，23.62，47.52，22.43，36.32，48.54 min，各成分间分离度良好，拖尾因子在0.95～1.05之间。

线性关系考察：取9种对照品2 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加入甲醇，充分溶解并稀释至刻度，即得混合对照品溶液。表小檗碱、盐酸药根碱、黄连碱、去氢吴茱萸碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱的质量浓度分别为0.165，0.205，0.202，0.203，0.203，0.205，0.201，0.201，0.204 mg/mL。分别取质量浓度为200，100，40，20，10，4，2，1，0.5μg/mL的混合对照品溶液10μL，按质量浓度从低到高注入色谱仪，按拟订色谱条件进样分析，记录色谱图，以质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归。结果见表1。

表1 9种成分的线性关系考察结果（n=9）

精密度试验：精密吸取混合对照品溶液10μL，按拟订色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果表小檗碱、盐酸药根碱、黄连碱、去氢吴茱萸碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱的RSD分别为0.39%，0.29%，0.29%，0.41%，0.49%，0.83%，1.16%，0.12%，0.30%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：称取同一左金胶囊粉末6份，每份0.1 g，精密称定，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果表小檗碱、盐酸药根碱、黄连碱、去氢吴茱萸碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱峰面积的RSD分别为1.30%，0.46%，1.18%，0.22%，0.44%，0.24%，0.74%，3.80%，1.81%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取同一左金胶囊粉末，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件分别在0，2，4，8，12 h时各进样10μL，记录峰面积。结果表小檗碱、盐酸药根碱、黄连碱、去氢吴茱萸碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱峰面积的RSD分别为0.22%，0.13%，0.27%，0.11%，0.80%，0.79%，0.90%，2.30%，1.08%（n=6），表明供试品溶液在12 h内稳定。

加样回收试验：称取已知含量的左金胶囊粉末0.025 g，精密称定，置50 mL容量瓶中，加入各对照品适量，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，并计算回收率。结果表小檗碱回收率为86.60%、RSD为5.03%，盐酸药根碱回收率为89.64%、RSD为4.90%，黄连碱回收率为86.22%、RSD为2.67%，去氢吴茱萸碱回收率为86.77%、RSD为5.86%，盐酸巴马汀回收率为96.89%、RSD为2.50%，盐酸小檗碱回收率为86.52%、RSD为5.76%，柠檬苦素回收率为87.40%、RSD为5.14%，吴茱萸碱回收率为88.39%、RSD为5.76%，吴茱萸次碱回收率为88.14%、RSD为4.00%（n=6）。

2.4 样品含量测定

取左金丸（温州、湖北）、左金胶囊（温州）适量，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定3种样品中9种成分的含量。结果见表2。可见，左金胶囊中除了盐酸小檗碱的含量较低外，其他8个成分的含量均高于左金丸，其中表小檗碱的含量最高；不同厂家生产的左金丸含量也不相同。

2.5 黄连-吴茱萸药对配伍比例确定

模拟胃液配置：精密吸取2.25 mL浓盐酸，置250 mL容量瓶中，加入200 mL水，振摇混匀，再加2.5 mg胃蛋白酶，加水使其充分溶解，并稀释至刻度，置于冰箱冷藏储存。

表2左金胶囊和左金丸中9种成分的含量测定结果（mg/g）

模拟肠液配置：称取1.402 7 g氢氧化钾（KOH）固体，精密称定，置250 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，振摇混匀，得0.1 mol/L的KOH溶液，储存于冰箱冷藏处，备用。

试验设计与结果：将市售黄连、吴茱萸药材分别经药材粉碎机粉碎成药物粉末，装袋，备用。称取0.1 g不同比例黄连-吴茱萸药材粉末（取用量见表3），置10 mL离心管中，加入2 mL人工胃液，37℃恒温震荡30 min，再用0.1 mol/L的碱溶液调节pH为6～8，再加入4 mg胰蛋白酶，恒温震荡30 min，再将离心管放入离心机中，以4 000 r/min离心4 min，取上清液置10 mL容量瓶中，加纯净水定容。取250μL药液，置1.5mLEP管，加入750μL甲醇，涡旋30 s，放入离心机中，以10 000 r/min的速率离心5 min，取上清液，过滤，进样测定。结果见表4。

仿生提取是提取中药复方化学成分的一种工艺手段，通过模拟人体胃肠道环境，其目的是提高有效成分。结果显示，当黄连-吴茱萸药材配伍比例为6∶1时，有效成分含量最高，通过观察不同比例配伍有效成分的溶出情况，可为其临床使用配比提供参考。

表3不同配伍比例黄连-吴茱萸药材取用量

表4不同配伍比例黄连-吴茱萸药材中9种成分含量测定结果（mg/g）

3 讨论

3.1 色谱条件优化

流动相选择：分别考察乙腈-水（每1 000 mL中含1 mL磷酸）和乙腈-水（每1 000 mL中含1 mL磷酸、0.5 mL三乙胺）为流动相进行梯度洗脱，对目标化合物的分离程度、杂质峰的干扰、拖尾因子等进行考察，最终确定乙腈-水（每1 000 mL中含1 mL磷酸、0.5 mL三乙胺）最佳流动相。

检测波长选择：为多种不同结构的生物碱能同时测定，分别考察于210，225，265，280，360 nm波长处的9种成分，各成分在225 nm波长处的分离效果最好，最终确定225 nm为检测波长。

3.2 溶液制备方法优化

分别考察了盐酸-甲醇（1∶100，V/V）、甲醇、甲醇-水（80∶20，V/V）和甲醇-水-盐酸（80∶20∶1，V/V/V）超声提取的效果，结果表明，甲醇-水-盐酸对各待测成分提取率最高。采用单因素分析方法，对提取溶剂体积20，40，80，100 mL（甲醇-水-盐酸，80∶20∶1，V/V/V）和超声时间60，50，40，30，20，10 min分别进行考察，且用80 mL超声30 min时各待测成分的提取率最高。

3.3 不同制剂中9种成分测定结果

本研究中采用HPLC法对市售左金胶囊、左金丸（温州、湖北）的9种成分的含量测定结果进行了比较，2015年版《中国药典（一部）》规定，左金胶囊每粒含黄连以盐酸小檗碱计，不得少于40 mg，左金丸中每1 g含黄连以盐酸小檗碱计，不得少于31 mg。本研究中所测左金胶囊每粒0.35 g中含有盐酸小檗碱72.065 mg（大于40 mg）；左金丸（温州）中每1 g含盐酸小檗碱68.602 mg，左金丸（湖北）中每1 g含盐酸小檗碱52.468 mg（均大于30 mg）。表明市售3种样品均为合格产品，但不同厂家的不同制剂中这9种成分的含量不同。

3.4 方法评价

本研究中采用HPLC法，以乙腈-含0.1%磷酸和0.05%三乙胺的水溶液为流动性进行梯度洗脱，建立了能同时测定左金丸和左金胶囊中9种成分含量的方法，该方法对该9种成分的分离效果及重复性均较好，简便易行，为制剂的质量控制和临床应用提供了依据。