基于网络药理学研究丹红化瘀汤治疗视网膜病变的潜在作用机制

吴 坚，张锡洪，徐文坚

（1.广东省汕头市中心医院·中山大学附属汕头医院，广东 汕头515000；2.广东省中山市小榄人民医院，广东 中山528400）

丹红化瘀口服液由陈达夫教授血府逐瘀汤加减化裁并通过特殊工艺研制而成，方中丹参（DS）、当归（DG）活血祛瘀、养血润燥，消目中之瘀血，为君药；川芎（CX）、桃仁（HR）、红花（HH）活血散瘀、疏肝行气，为臣药，助君药行消目中瘀血积滞之效；柴胡（CH）、枳壳（ZQ）疏肝理气开郁，使气机条畅、气血调和，为佐药。诸药合用，共奏活血化瘀、行气通络之功效，适用于气滞血瘀引起的视物模糊等症。常见视网膜病变包括糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉阻塞、黄斑病变、新生儿视网膜病变等，以视力变化、眼底出血、渗出、水肿、增殖等为常见临床表现，属中医“视瞻昏渺”“云雾移睛”“暴盲”等范畴，临床辨证包括气滞血瘀、络脉瘀阻、肝肾亏虚等。丹红化瘀口服液对糖尿病性视网膜病变（DR）、视网膜静脉阻塞（RVO）等视网膜病变有较好疗效，尤其对视网膜血管病变引起的多种疾病有良好疗效，临床应用前景广阔。研究表明，丹红化瘀口服液对DR有效率达82.75%，可明显降低血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）水平，同时改善血液流变学指标，减轻眼底出血情况，改善眼底的循环障碍，减少微血管瘤形成，促进视力恢复，减缓DR病情进展[1-4]。另有试验表明，丹红化瘀口服液可下调RVO患者房水中VEGF和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平，下调血清VEGF、TNF-α、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）和炎性因子细胞间黏附分子-1（ICAM-1）水平，抑制新生血管形成，促进眼底出血吸收和消退，减轻炎性损伤，改善视力[5-7]。网络药理学是在系统生物学与计算机技术高速发展的基础上发展起来的，基于疾病基因-靶点-药物交互作用网络的基础上，通过网络分析，系统综合地观察药物对疾病网络的干预与影响[8]。本研究中基于丹红化瘀汤多成分、多靶点作用的特点，遵循网络药理学理论与技术，通过筛选丹红化瘀汤药物活性成分、预测丹红化瘀汤治疗视网膜病变的靶点及靶点的生物功能和通路分析，构建化合物-靶点-通路网络，预测和阐述丹红化瘀汤治疗视网膜病变的分子作用机制，为药物的试验研究及临床应用提供科学依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 丹红化瘀汤的活性成分及靶点收集与筛选

在中药系统药理数据库和分析平台（TCMSP，http：//tcmspw.com/index.php）上设定参数口服利用度（OB）≥30%且类药性（DL）≥0.18[9]，筛选丹红化瘀汤组方中7味中药在人体内生物活性较高的化合物成分 及 其 靶 点，通 过Pubchem数 据 库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）验证获取化合物分子机构，通过String数据库（https：//string-db.org）搜索TCMSP平台所获取靶点蛋白，设定物种为人（homosapiens），获得靶点采用官方名称。

1.2 视网膜病变相关靶点的收集及筛选

在OMIM数据库（https：//omim.org/）、TTD数据库（http：//db.idrblab.net/ttd/）和GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）检 索“RetinalDiseases”获取视网膜病变相关靶点，并通过String数据库，设定物种为人（homosapiens），获得靶点采用官方名称。

1.3 丹红化瘀汤治疗视网膜病变靶点的预测及网络构建

通过比对丹红化瘀汤化合物靶点及视网膜病变相关靶点，预测丹红化瘀汤治疗视网膜病变的靶点，将药物、化合物、治疗靶点、疾病信息导入Cytoseape_v3.7.2软件（http：//www.cytoscape.org/），构建药物-化合物-靶点-疾病网络并进行拓扑分析，根据介度（BC）、紧密度（CC）的中位数及连接度（Degree）中位数的2倍值卡值筛选丹红化瘀汤治疗视网膜病变的关键药效分子。将预测靶点信息导入String数据库，设定物种为人（homosapiens），选择高置信度，获得丹红化瘀汤治疗视网膜病变靶点的交互作用关系信息，在Cytoseape中构建靶点间的交互作用网络，并进行拓扑分析，根据BC和CC的中位数及Degree中位数的2倍值来卡值筛选核心靶点，并构建核心靶点交互作用网络。

1.4 丹红化瘀汤治疗视网膜病变关键靶点的验证

以阳性药物羟苯磺酸钙作为对照，使用分子对接模拟软件Autodock_vina对Degree值前10的核心靶点与Degree值前10的关键药效分子进行分子对接验证。

1.5 生物功能与通路富集分析及药物-化合物-靶点-通路网络构建

将丹红化瘀汤治疗视网膜病变靶点导入David6.8数 据 库（https：//david.ncifcrf.gov/），设 定 物 种 为 人（homosapiens），进行GO生物学富集分析及KEGG通路富集分析，收集P＜0.05的结果。在Cytoseape中构建药物-化合物-靶点-通路网络。

2 结果

2.1 丹红化瘀汤的活性成分及靶点

在TCMSP平台上根据口服利用度（OB）≥30%且类药性（DL）≥0.18[8]，剔除重复化合物及缺少靶点预测的化合物，通过Pubchem验证分子结构，共收集到丹红化瘀汤组方中7味中药的109种活性成分，其中丹参含有49种，当归含有2种，红花含有17种，桃仁含有18种，柴胡含有13种，川芎含有6种，枳壳含有5种。OB和DL排名前30的活性成分信息见表1。根据活性成分TCMSP平台收集靶点信息，经String数据库校正后，共获得260个靶点。

2.2 药物-化合物-靶点-疾病网络构建及关键药效分子分析

从OMIM数据库、TTD数据库、GeneCards数据库收集筛选到8 030个视网膜病变相关靶点，在与丹红化瘀汤靶点比对后，结果丹红化瘀汤的106种活性成分的227个靶点可作为治疗视网膜病变的潜在靶点。在Cytoseape中构建丹红化瘀汤治疗视网膜病变的药物-化合物-靶点-疾病网络并进行拓扑分析，结果BC中位数为0.000 544 245，CC中位数为0.365 342 16，Degree中位数2倍值为10，根据该结果筛选出关键药效分子32个，如槲皮素（MOL000098）、山柰酚（MOL000422）、木犀草素（MOL000006）、柚皮素（MOL004328）等，度值越高，活性成分相关治疗靶点越多，关键药效分子可能在丹红化瘀汤治疗视网膜病变的过程中起到了重要作用，其信息及度值见表2。药物-化合物-靶点-疾病网络见图1，其中深绿色节点为关键药效分子。

表1 OB和DL排名前30的丹红化瘀汤活性成分信息

2.3 靶点交互作用网络构建及核心靶点分析

基于String数据库分析227个靶点间的交互作用，获取高置信度结果，在Cytoseape中构建丹红化瘀汤治疗视网膜病变靶点的交互作用网络并进行拓扑分析，结果BC中位数为0.001 6，CC中位数为0.42，Degree中位数2倍值为28，以上述数值卡值筛选获得41个核心靶点，其信息与拓扑参数见表3。经String数据库分析后，在Cytoseape中构建丹红化瘀汤治疗视网膜病变的核心靶点高置信度交互作用网络图，详见图2，网络图共有41个节点，507条边，节点Degree值越高，颜色越深，直径越大。

表2丹红化瘀汤治疗视网膜病变的关键药效分子信息

2.4 分子对接模拟验证结果

应用分子对接模拟软件Autodock_vina对Degree值前10的活性成分与靶点进行分子对接验证，10个靶点蛋白信息见表3，槲皮素（MOL000098）与MAPK3的分子对接模拟可视化图见图3。可见，槲皮素与周围分子之间存在氢键、芳环堆积作用、范德华力等不同分子间交互作用，与受体分子能较好地结合。应用Autodock_vina计算药效分子与受体间的最低结合能并作热图，详见图4。可见，所有药效分子与靶点蛋白受体的最低结合能都小于0，两者可自发结合，靶点蛋白AKT1，TP53，MAPK8，MAPK1，JUN，VEGFA，EGF，MAPK3，STAT3与10个关键药效分子最低结合能均小于-5.0 kJ/mol，提示上述靶点蛋白与药效分子结合较好[10]，且阳性对照药物羟苯磺酸钙与靶点蛋白分子对接的最低结合能均在-5.0 kJ/mol，验证了靶点蛋白晶体及配体选择的合理性。

图1丹红化瘀汤治疗视网膜病变的药材-成分-靶点-疾病网络图

2.5 GO富集分析和KEGG通路分析

应用David数据库对221个丹红化瘀汤治疗视网膜病变的靶点进行GO富集分析和KEGG通路分析，取P＜0.05的结果，共收集到761个GO条目，572个生物过程条目，67个细胞组分条目，122个分子功能条目。筛选与视网膜病变有关的P值最小的前20个GO条目作图，详见图5。其中，炎性反应、细胞老化、血管生成、血管生成的正调控、平滑肌细胞增殖的正调控等富集程度高，且与视网膜病变关系密切。KEGG通路分析共富集到58条与视网膜病变的通路，取P值最小的前20个作图，详见图6，其中TNF信号通路、低氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶（PI3K-AKT）信号通路、VEGF信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路等富集度高且与视网膜病变关系密切。

2.6 药物-化合物-靶点-通路网络构建

在Cytoscape中构建药材-成分-靶点-通路网络，详见图7，其中同类颜色深者为关键药效分子或核心靶点。网络图中共有343个点和1 404条边，丹红化瘀汤组方中的7味中药、206种化合物、227个靶点与20条不同的通路相关，共同调节机体的生理基础与代谢功能，提示丹红化瘀汤对视网膜病变的治疗作用机制有着多成分、多靶点、多通路的特点。

3 讨论

丹红化瘀汤有活血化瘀、行气通络的功效，对DR和RVO等视网膜病变有良好疗效。本研究中基于多成分、多靶点作用的研究思路，应用网络药理学技术对丹红化瘀汤治疗视网膜病变的靶点进行分析，构建药物-化合物-靶点-通路网络，阐述丹红化瘀汤治疗视网膜病变的分子作用机制，为丹红化瘀汤的试验研究和临床应用提供依据。

表3丹红化瘀汤治疗视网膜病变的核心靶点及其拓扑参数

图2丹红化瘀汤治疗视网膜病变的核心靶点高置信度交互作用网络

图3槲皮素（MOL000098）与MAPK3的分子对接模拟可视化图

在筛选出的关键药效分子中，多为黄酮类化合物及其衍生物，如槲皮素、柚皮苷、黄芩苷、丹参酮、毛地黄黄酮等。黄酮类化合物在中草药及天然产物中分布广泛，并有抗炎、抗菌和抗氧化活性[11]。研究表明，黄酮类化合物对氧化诱导的在体和离体视网膜色素上皮细胞均有保护作用[12]；柚皮苷能减轻糖尿病性视网膜病变试验模型中的炎性反应、氧化应激和核因子κB（NF-κB）活化[13]；槲皮素可通过抑制自噬而对高糖诱导的脉络膜和视网膜血管生成发挥抑制作用[14]，从而延缓DR进程；黄芩苷有明显抑制视网膜细胞外炎性水肿的作用[15]；丹参酮ⅡA会明显抑制高糖环境下人视网膜血管内皮细胞的增殖、迁移、血管成形方面的体外生物学作用，对于防治DR的发生，延缓其病理进程，可起到一定作用[16]。此外，天然类黄酮化合物可影响眼球血流量，其中毛地黄黄酮等含有多个羟基基团的黄酮分子，可显著提高眼球血流量和促进视网膜功能的恢复。可见，以黄酮类化合物为主的关键药效分子在丹红化瘀汤治疗视网膜病变的生物学过程中发挥着重要作用。

图4 Degree值前10的关键药效分子与核心靶点分子对接最低结合能热图

表4 Degree值前10靶点的受体蛋白信息

基于丹红化瘀汤治疗视网膜病变靶点的交互作用，网络分析共收集到41个核心靶点，结合分子对接验证结 果 分 析 发 现，AKT1，TP53，MAPK8，MAPK1，JUN，VEGFA，STAT3，EGF，MAPK3可能是丹红化瘀汤治疗视网膜病变的关键靶点，分别从炎性反应、氧化应激、新血管生成、细胞增生与凋亡等生物过程发挥治疗作用。这9个靶点与所选的10个关键药效分子最低结合能均小于-5.0 kJ/mol，表明上述靶点与活性成分有结合活性，从分子与靶点的作用角度验证了核心靶点筛选结果的合理性。

图5 GO生物富集分析气泡图

图6 KEGG通路富集分析气泡图

图7丹红化瘀汤治疗视网膜病变的药材-成分-靶点-通路网络

VEGF是一种高度特异的血管内皮细胞有丝分裂素，能刺激血管内皮细胞的有丝分裂与迁移，增加血管的通透性，诱导毛细血管腔的形成，在新生血管性视网膜病变中可发挥重要作用。视网膜静脉阻塞、增生型糖尿病视网膜病变和早产儿视网膜病变等疾病有类似的发病机制[17]，即在视网膜缺氧、缺血环境下，多种细胞分泌VEGF，其高表达可导致视网膜新生血管形成[18]。此外，VEGF还可通过影响其他细胞因子和通路活性导致视网膜新生血管生成；上调视网膜血管的ICAM-1表达水平，增强血小板聚集功能，促进白细胞黏附，使视网膜缺血缺氧情况持续加重，加速新生血管形成[19]。低氧和高糖环境下，VEGF过度表达，通过受体KDR和FIT-1，能诱导下游PI3K-AKT信号通路的激活，可加速内皮细胞发生迁移、增殖，形成新生微血管腔[20]，加速病情发展。丹红化瘀汤中丹参的活性成分丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、隐丹参酮、异丹参酮等能调节VEGF表达，抑制血管新生成，能起到减缓DR病情进展的作用。丹参、红花、柴胡中的黄芩苷能通过抑制氧化应激，增强缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）降解，降低VEGF分泌，表现出抗血管生成作用[21]。研究表明，丹参化瘀汤能调节VEGF表达，降低血管通透性，减少新生血管生成，改善血液流变学指标，预防纤维增生，延缓病情发展[5-7]。

蛋白激酶B（AKT）属丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，控制增殖、凋亡、代谢、转导等重要的细胞功能，其与新生血管的形成密切相关[22]，被视为病理性血管形成治疗的有效方法[23]。研究表明，缺氧环境下对氧诱导的视网膜病变模型小鼠玻璃体腔内注射AKT抑制剂后，能明显减少视网膜新生血管的形成[24]，提示AKT活性会影响新生血管性视网膜病变的产生与发展。AKT是PI3K下游的直接作用靶点，PI3K-AKT通路在KEGG通路分析中富集基因较多，且与VEGF信号通路、mTOR信号通路等通路密切相关。增生性玻璃体视网膜病变（PVR）的增殖期中，激活PI3K-AKT信号通路及其下游的mTOR信号通路会使眼内细胞增殖与凋亡平衡失调，导致PVR的形成[25]。槲皮素可直接与PI3K的ATP结合位点结合抑制其活性，并能竞争性抑制AKT活性[26]，通过抑制AKT和MAPKs家族，使NF-κB信号失活，从而抑制VEGF诱导的视网膜光感受器细胞过度炎性反应[27]。可见，丹红化瘀汤可能通过抑制AKT的磷酸化与PI3K-AKT通路的激活，调控细胞增殖与凋亡及新生血管的生成，达到治疗视网膜病变的效果。

表皮生长因子（EGF）是促视网膜色素上皮细胞（RPE）增生最强的生长因子，EGF及其受体EGFR能诱导RPE细胞增生、移行，并可引起其形态改变[28]，进而促进PVR的发生、发展。EGF与EGFR结合后能激活MAPK信号通路和PI3K/AKT信号通路，调节EGF、VEGF等细胞因子的表达，并共同参与RPE细胞的增生与迁移[29]。研究表明，槲皮素对由EGF刺激引起的RPE细胞增生抑制作用很强[26]，丹红化瘀汤可通过抑制EGF引起的RPE细胞增生达到缓解PVR病情的效果。

综上所述，本研究中应用网络药理学方法对丹红化瘀汤治疗视网膜病变的分子作用机制进行了研究，分析了丹红化瘀汤治疗视网膜病变的关键药效分子核心靶点，并应用分子对接模拟技术对核心靶点进行了验证，构建了丹红化瘀汤治疗视网膜病变的靶点交互作用网络和药物-化合物-靶点-通路网络，主要阐述了丹红化瘀汤通过多靶点、多通路作用从抗炎、抗氧化、调节细胞增生、细胞凋亡及新血管生成等方面发挥治疗视网膜病变的潜在机制，为丹红化瘀汤治疗视网膜病变的临床应用及作用机制的研究提供了参考依据。