小柴胡颗粒薄层鉴别方法研究*

冯文明，沙炜，周丹丹

（鉴甄检测技术＜上海＞有限公司，上海200131）

小柴胡颗粒源自东汉张仲景《伤寒杂病论》记载的经典名方小柴胡汤，为和解剂之祖方，由党参（原方为人参）、柴胡、黄芩、姜半夏、生姜、大枣、甘草7味中药组方，具有解表散热、疏肝和胃之功效，主要用于外感病、邪犯少阳证等。目前，小柴胡颗粒执行2015年版《中国药典（一部）》质量标准[1]，涉及柴胡、黄芩和甘草3个独立的薄层色谱鉴别，操作复杂、耗时、低效、高成本。本研究中在现有标准和现有文献[2-3]基础上，建立了“一板多药”的鉴别方法，可同时对小柴胡颗粒中柴胡（君药）、黄芩（臣药）和甘草（佐使药）3味药材进行薄层色谱鉴别，操作简单快速，专属性强，耐用性好，进一步完善了小柴胡颗粒的质量标准。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

ATS4型薄层色谱自动点样仪，Visualizer 2型薄层色谱成像系统，均购自瑞士卡玛公司；TH-Ⅱ型薄层加热器（上海科哲生化科技有限公司）；KBF（E5.3）型恒温恒湿箱（德国宾得公司）；XSE105DU型电子天平（梅特勒-托利多＜上海＞有限公司，精度为十万分之一）；QUINTIX2102-1CN型电子天平（赛多利斯科学仪器＜北京＞有限公司，精度为百分之一）；P120H型超声波清洗仪（德国Elma公司，功率为1 130 W，频率为50/60 kHz）；TW20型恒温水浴锅（德国优莱博公司）；ST-40R型高速冷冻离心机、ST-40型高速离心机（赛默飞世尔科技公司）；A10型超纯水系统（美国密理博公司）。

1.2 试药

柴胡对照药材（批号为120992-201509），黄芩对照药材（批号为120955-201810），甘草苷对照品（批号为111610-201908），均购自中国食品药品检定研究院；柴胡皂苷b2对照品（批号为Z04S9L69482，上海源叶生物科技有限公司）；柴胡皂苷H对照品（批号为DST191009-014，成都德思特生物技术有限公司）；小柴胡颗粒（规格为每袋10 g，批号分别为k90106，k90108，k90116，k90117，k90125，k90141，k90143，k90148，k90150，k90155，k90156，k90157，k90158，k90159，k90162）；柴胡药材、黄芩药材、甘草药材、柴胡阴性制剂、黄芩阴性制剂、甘草阴性制剂，均购自广州白云山光华制药股份有限公司，由本公司孟千万讲师鉴定为正品。HSGF254型薄层色谱硅胶预制板（烟台市化学工业研究所，银龙板，批号为20190912）；HPTLC Silica gel 60 F254（1.05642）型Merck板（德国Merk公司，批号为HX87113742）；HPTLC-Fertigplatten Nano-SIL-20 UV254（811023）型MN板（德 国MN公 司，批 号 为309259）；其余试剂均为分析纯，购自上海泰坦科技股份有限公司。

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1 溶液制备

取样品2 g，加15 mL水，超声处理（功率为330 W，频率为37 kHz）使溶解，用水饱和正丁醇萃取2次，每次15mL，合并正丁醇液，用1%氢氧化钠溶液10mL洗涤，取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1 mL，溶解，作为供试品溶液。

取柴胡对照药材0.5 g，加入30 mL水，加热回流1.5 h，放冷，滤过，滤液自“用水饱和正丁醇萃取2次”起同法制备柴胡对照药材溶液。

取黄芩对照药材0.1 g，加4 mL甲醇，超声20 min，离心，取上清液，作为黄芩对照药材溶液。

取甘草苷对照品、柴胡皂苷b2对照品、柴胡皂苷H对照品适量，分别加入甲醇制成每1 mL含0.1 mg甘草苷、0.5 mg柴胡皂苷b2、0.2 mg柴胡皂苷H的溶液，作为对照品溶液。

2.1.2 “一板多药”定性鉴别

照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述对照品溶液和供试品溶液5～10μL，对照药材溶液1～2μL，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，使其成条带状（8 mm），以乙酸乙酯-丙酮-无水甲酸-水（7∶1∶1∶1，V/V/V/V）为展开剂，展开缸滤纸饱和20 min，展距6 cm，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液，在105℃加热3～4 min，置紫外灯（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与柴胡皂苷b2、柴胡皂苷H对照品、柴胡对照药材溶液色谱相应位置上显相同棕红色荧光斑点；在与黄芩对照药材色谱相应位置上显相同的蓝色荧光斑点；在与甘草苷对照品溶液色谱相应位置上显相同的黄色荧光斑点。

2.2 结果

2.2.1 专属性考察[4]

分别取阴性制剂2 g，按供试品溶液制备方法制备阴性制剂溶液并点样，色谱图见图1。结果在与柴胡皂苷b2、柴胡皂苷H对照品、柴胡对照药材溶液色谱相应位置上，供试品溶液（批号为k90108，k90116，k90125）显相同的棕色荧光斑点；在与黄芩对照药材溶液色谱相应位置上显相同的蓝色荧光斑点；在与甘草苷对照品溶液色谱相应位置上显相同的黄色荧光斑点，且阴性制剂均无干扰，表明此方法专属性强。

2.2.2 耐用性考察[4]

考察不同厂家的高效硅胶板（Merck板，MN板和银龙板）、不同展开温度（10，20，30℃）和不同展开相对湿度（30%，50%，70%）对其薄层色谱行为的影响。结果见图2。可见，上述因素对小柴胡颗粒的薄层色谱行为影响较小，本方法斑点清晰，耐用性良好。

图1专属性试验薄层色谱图

2.3 样品检测

另取12批样品验证方法的适用性。结果见图3，供试品溶液色谱中，在与柴胡皂苷b2对照品、柴胡皂苷H对照品溶液色谱相应位置上显相同的棕红色荧光斑点；在与黄芩对照药材溶液色谱相应位置上显相同的蓝色荧光斑点；在与甘草苷对照品溶液色谱相应位置上显相同的黄色荧光斑点。对照品甘草苷Rf=0.66，柴胡皂苷b2Rf=0.42，柴胡皂苷HRf=0.31，黄芩鉴别点Rf=0.26。

3 讨论

薄层色谱法操作简单灵活，专属性强，可快速有效地鉴定真伪，在中药分析领域应用广泛[5-6]，美国药典（USP）和欧洲药典（EP）均推荐用于天然药物的鉴别。

2015年版《中国药典（一部）》小柴胡颗粒标准中，需要进行3次薄层色谱鉴别。柴胡鉴别的供试品溶液需通过聚酰胺柱进行制备；甘草对照药材需用水煎煮提取；黄芩鉴别需调节pH、萃取等。操作烦琐、耗时，检测效率低，成本高。因此，有必要提升和优化小柴胡颗粒的鉴别方法。

柴胡为方中君药，其中皂苷类成分以柴胡皂苷a和柴胡皂苷d为主，柴胡经煎煮后，两者会转换成柴胡皂苷b1和b2[7-8]。第17版《日本药典》（日本药局方）中小柴胡汤的质量标准[9]分别以柴胡皂苷b2和甘草苷对照品为对照对柴胡和甘草进行鉴别。采用模拟制剂生产工艺的方法，对柴胡药材和甘草药材加热回流提取后，按供试品溶液制备方法制备。其中，柴胡药材有2个特征斑点（Rf=0.42，0.30）传递到制剂中，分别为柴胡皂苷b2和柴胡皂苷H。前期研究发现，甘草药材中有1个特征斑点（甘草苷，Rf=0.64）传递到制剂中。考虑到柴胡皂苷H对照品不易购买，且价格昂贵，可选择以柴胡皂苷b2和柴胡对照药材为参照，对小柴胡颗粒中的柴胡进行鉴别。

图2耐用性试验薄层色谱图

图3样品检测薄层色谱图

2015年版《中国药典（一部）》标准中仅使用黄芩苷鉴别黄芩。本方法中检测出了一个具有黄芩专属性的特征斑点（Rf=0.24），可丰富黄芪药材鉴定信息。经试验发现，经甲醇超声处理后就能提取出黄芩药材的特征斑点，最终确定黄芩对照药材以超声处理方式制备。

党参炔苷为党参的主要有效成分，曾考察2015年版《中国药典（一部）》中小柴胡胶囊和小柴胡泡腾片[1]项下党参的TLC鉴别方法。研究发现，供试品溶液与阴性制剂的薄层色谱行为完全一致，故药典方法无法实现转移。同时，采用不同的展开体系仍未检出党参炔苷。液相色谱法分析结果显示，小柴胡颗粒中党参炔苷的含量非常低，无法作为TLC的特征成分进行鉴别。6-姜辣素为生姜的主要有效成分，但在制剂中未检出6-姜辣素，且液相色谱结果佐证此结果。推测可能是，在浓缩过程中6-姜辣素等芳香性成分受到了损失。半夏主要成分是淀粉，少量氨基酸和其他小极性成分，在制剂中未检出氨基酸色谱条带。大枣主要成分是多糖及三萜类成分（如齐墩果酸和白桦脂酸等），尝试以齐墩果酸和白桦脂酸为对照，均未检出相应条带。因此，下阶段的工作重点是建立党参、生姜、半夏、大枣的薄层色谱鉴别方法。

对“一板多药”鉴别方法展开剂的考察，确定乙酸乙酯-丙酮-无水甲酸-水（7∶1∶1∶1，V/V/V/V）、乙酸乙酯-丙酮-无水甲酸-水（5∶2∶1∶1，V/V/V/V）、乙酸乙酯-正丁醇-无水甲酸-水（5∶2∶1∶1，V/V/V/V）3个展开系统。通过考察不同展开剂对供试品溶液的色谱条带成点性、分离度及Rf值的影响，确定最佳展开系统。结果表明，3个展开系统均能在与柴胡皂苷b2对照品溶液、柴胡皂苷H对照品溶液色谱相应位置上显相同的棕红色荧光斑点；在与黄芩对照药材溶液色谱相应位置上显相同的蓝色荧光斑点；在与甘草苷对照品溶液色谱相应位置上显相同的黄色荧光斑点。展开剂为乙酸乙酯-丙酮-无水甲酸-水供试品溶液色谱有条带重叠，且整体Rf值较高；展开剂为乙酸乙酯-正丁醇-无水甲酸-水，各条带虽分离相对较好，但展开系统中含有正丁醇，气味较大，且有神经毒性；展开剂为乙酸乙酯-丙酮-无水甲酸-水时，各条带分离度好，整体Rf较合理。故选择乙酸乙酯-丙酮-无水甲酸-水作为“一板多药”鉴别的展开系统。

综上所述，所建立的“一板多药”鉴别方法，简单、高效，专属性强，可同时定性鉴别小柴胡颗粒中的柴胡、黄芩、甘草，完善和提升了其质量标准。