高效液相色谱法测定清补通络丸中丹酚酸B含量*

邱远金，王 林，周卫刚，宋海龙，李江涛，刘纪杉，李晓瑾，高 辉，朱国强

（1.新疆维吾尔自治区中药民族药研究所，新疆 乌鲁木齐830002；2.新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐830054；3.新疆维吾尔自治区第六人民医院，新疆 乌鲁木齐830013）

布鲁氏杆菌病（Brueellosis）简称布病，是一种由革兰阴性杆菌[布鲁氏杆菌属细菌（Brucella）]侵入机体后引起的变态反应性传染病[1]，分为急性期和慢性期，急性期主要采用西药治疗，慢性期提倡中药治疗，中医针对病因病机辨证给予具有补气扶正、活血化瘀、清热祛湿、通络止痛等功效的中药治疗[2-3]。清补通络丸由丹参、党参、黄芪、独活等15味中药组方，丹参为君药。丹参富含丹参酮ⅡA、丹酚酸B、丹参素等化学成分，其中丹酚酸B（Sal B）是标志性有效成分之一，含量较高（≥3.0%）[4]，且对照品易于获取，目前研究得最多；丹酚酸B具有改善缺血、缺氧所致的心肌细胞损伤，抑制心血管收缩、抗动脉粥样硬化等药理活性，故选择丹酚酸B作为含量测定的指标性成分[5-10]。本研究中采用高效液相色谱（HPLC）法测定清补通络丸中丹酚酸B含量，并进行方法学考察，旨在为有效控制药物的质量和保障用药安全提供依据。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

SK5200HP型超声仪（昆山市超声仪器有限公司，功率为140 W，频率为42 kHz）；AB265-S型电子分析天平（梅特勒-托利多国际贸易＜上海＞有限公司，精度为十万分之一）；Ultimate3000型高效液相色谱仪（赛默飞世尔公司）。

1.2 试药

丹酚酸B对照品（中国食品药品检定研究院，批号为WKQ18042503）；清补通络丸（新疆维吾尔自治区中药民族药研究所，自制，规格为每10丸重1.4 g，批号分别为20170321，20170322，20170323）；甲醇、乙腈均为色谱纯；磷酸为分析纯；水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：ACE 5 Super C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸（22∶78，V/V）；检测波长：286 nm；流速：1.2 mL/min；进样量：10μL；柱温：25℃。

2.2 溶液制备

对照品溶液：取丹酚酸B对照品适量，置50 mL容量瓶中，加甲醇-水（8∶2，V/V）溶液溶解，定容，得质量浓度为306.2μg/mL（即0.306 2 mg/mL）的对照品溶液。

供试品溶液：取样品适量，粉碎，称取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇-水（8∶2，V/V）混合溶液50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率为140 W，频率为42 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇-水（8∶2，V/V）混合溶液补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：取缺丹参的阴性对照品0.5 g，精密称定，按供试品溶液制备方法制备溶液，即得。

2.3 方法学考察

系统适用性及阴性干扰试验：分别取对照品溶液、供试品溶液、缺丹参的阴性对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，见图1。结果丹酚酸B对照品峰与供试品溶液丹酚酸B峰的保留时间一致，阴性对照品溶液在相应位置处未出现丹酚酸B吸收峰，且丹酚酸B色谱峰与其他组分色谱峰分离完全，表明处方中其他药材对丹酚酸B的含量测定无干扰。

图1高效液相色谱图

线性关系考察：分别精密吸取2.2项下对照品溶液1，2，3，5，10 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇-水（8∶2，V/V）溶液定容，精密吸取10μL，注入色谱仪，按拟订色谱条件测定，以峰面积（Y）为纵坐标、丹酚酸B质量浓度（X）为横坐标进行线性回归，得回归方程Y=0.177X-5.856 1，r=0.997 5（n=6）。结果表明，丹酚酸B质量浓度线性范围为30.62～360.20μg/mL。

精密度试验：吸取同一对照品溶液（306.20μg/mL）10μL，重复进样6次，按拟订色谱条件测定峰面积。结果峰面积的RSD为0.63%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液10μL，按拟订色谱条件分别于0，2，4，8，16，24 h时测定丹酚酸B的峰面积。结果峰面积的RSD为1.24%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验：精密称取同一批（批号为20170321）样品6份，依法制备供试品溶液，并测定丹酚酸B含量。结果平均含量为10.783 9 mg/g，RSD为1.70%（n=6），表明方法重复性良好。

耐用性试验：分别考察不同流速、不同柱温、不同流动相比例、不同波长、不同型号色谱柱对丹酚酸B含量的影响。结果柱温、流速、流动相比例、检测波长、色谱柱等条件微小变化时，供试品中丹酚酸B含量的检测结果无明显差异，表明该方法的色谱条件耐用性良好。

加样回收试验：称取同一批（批号为20170321，丹酚酸B含量为10.783 9 mg/g）样品6份，各0.25 g，精密称定，分别精密加入10 mL对照品溶液（质量浓度为0.306 2 mg/mL）和40 mL甲醇-水（8∶2，V/V）溶液，依法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液，按拟订色谱条件测定峰面积，计算平均回收率和RSD。结果见表1。

表1丹酚酸B加样回收试验结果（n=6）

2.4 样品含量测定

取3批样品（批号分别为20170321，20170322，20170323），按丹酚酸B含量测定方法进行测定。结果3批样品丹酚酸B的含量分别为10.976 7，10.852 7，11.262 0 mg/g，平均含量为11.030 5 mg/g，RSD为1.90%（n=3）。

3 讨论

丹酚酸B含量的测定方法有HPLC法、红外光谱法、毛细管电泳法[11]，其中HPLC法较常用[12-16]。清补通络丸是医院制剂，临床反映疗效良好。本研究中参考2015年版《中国药典（一部）》，建立了检测清补通络丸中丹酚酸B含量的HPLC法，并进行方法学验证。本方法测定结果稳定，分离效果较好，阴性对照对试验结果无干扰，可用于测定清补通络丸中丹酚酸B的含量。清补通络丸由多味中药组方，成分复杂，为更好控制其质量，还需要建立其他有效成分含量检测方法。