疏穗处理对‘赤霞珠’葡萄果皮类黄酮物质的影响

曾桂花，高飞飞，高邦牢，惠竹梅,2,，张振文,2,

（1.西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西省葡萄与葡萄酒工程中心，陕西 杨凌 712100）

类黄酮物质是植物中重要的次级代谢产物，广泛分布于植物的根、茎、叶和果实中，在植物生长发育过程中起重要作用[1-2]。此外，类黄酮物质可以清除人体内的自由基，具有抗氧化、抗衰老和降低心血管疾病等保健功能[3-4]。在葡萄中，花色苷、黄烷-3-醇和黄酮醇是最重要的3 种类黄酮物质[5]。

花色苷是由花色素与糖基以糖苷键结合形成的一类化合物，是葡萄和葡萄酒的主要呈色物质。葡萄果实中的花色苷主要有花翠素、花青素、甲基花翠素、甲基花青素和二甲花翠素5 种形式[6]。此外，花色苷的糖残基可以与芳香族化合物或脂肪酸发生葡萄糖苷酰化反应。酰化花色苷较非酰化花色苷具有更强的化学稳定性，有利于葡萄酒颜色的稳定[7]。黄烷-3-醇是葡萄果实中一类重要的类黄酮物质，其单体可以通过缩合或聚合作用形成缩合单宁，是葡萄酒中苦味和涩味的主要来源，构成了葡萄酒的基本骨架[8-9]。此外，黄烷-3-醇可以与色素分子结合，有利于葡萄酒颜色的稳定[10]。黄酮醇类物质具有很好的辅色作用，可以与花色苷作用生成稳定的复合物，增强和保护葡萄酒的颜色[11]。

类黄酮物质是葡萄果实和葡萄酒重要的质量参数之一，其种类和含量受品种[12]、温度[13-14]、光照[15-16]、水分[17]和栽培管理措施[18-19]等因素的影响。疏穗处理是一种在葡萄栽培中常用的提高其果实品质的技术管理手段。研究表明，葡萄疏穗处理有助于葡萄果实类黄酮物质的合成和积累[20-22]。但是由于产地和品种等因素的不同，相同的疏穗处理可能导致不同的结果。因此，为特定葡萄酒产区的葡萄品种确定适合的疏穗方案至关重要。本研究通过分析不同疏穗处理对山西乡宁县酿酒葡萄‘赤霞珠’果皮类黄酮物质的影响，为制定该地区‘赤霞珠’葡萄最佳疏穗方案提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试酿酒葡萄‘赤霞珠’（Vitis viniferaL. Cabernet Sauvignon）于2012年定植在山西省乡宁县（35.97°N，110°E），该地年平均气温9.9 ℃，年降水量570 mm，年均无霜期212 d，行株距为2.5 m×1.2 m，采用水平式独龙蔓树形和单臂篱架架式[23]。

坐果后20 d进行手动疏穗处理。设置3 个疏穗水平：不疏除果穗（CK）、疏除27%果穗（C1）、疏除54%果穗（C2）。每个疏穗水平选取30 株长势一致的植株进行处理。为了避免边际效应，处理两侧各两行葡萄植株，两端各5 株植株不进行采样。果实采收期，每处理兼顾植株的阴面与阳面随机采样20 穗，样品装在泡沫箱中运回实验室后立即剪下全部果粒，混匀后保存于－40 ℃超低温冰箱待用。

氢氧化钠、葡萄糖、甲醇、甲酸、乙酸乙酯（均为分析纯） 天津市博迪化工有限公司；甲醇、甲酸、乙腈和乙酸（均为色谱级） 美国Fisher公司；类黄酮标准品：二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、儿茶素、表儿茶素、表没食子酸儿茶素、表儿茶素没食子酸酯和槲皮素-3-O-葡萄糖苷 美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

PAL-1数显手持式折糖仪 日本Atago公司；UV-1800紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；FD5系列真空冷冻干燥机 美国Gold Sim公司；5804R型高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；CentriVap低温冷冻浓缩仪 美国Labconco公司；1100系列LC/MSD Trap-VL液相色谱-离子阱质谱联用仪（配二极管阵列检测器）美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 果实基本理化指标测定

可溶性固形物含量使用数显手持式折糖仪测定；果粒质量使用电子天平测定；果粒横径使用游标卡尺测定；还原糖含量测定采用斐林试剂滴定法，结果以葡萄糖计；总酸含量测定采用氢氧化钠滴定法，结果以酒石酸计[24]；总酚含量测定采用福林-肖卡法，结果以没食子酸计；总花色苷含量测定采用pH示差法，结果以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷计；单宁含量测定采用甲基纤维素法，结果以儿茶素计[25]。

1.3.2 果皮单体花色苷测定

每个处理随机选取100 粒葡萄，在冷冻状态下剥皮，经液氮研磨后于真空冷冻干机中冷冻24 h，充分冷冻干燥后保存在－80 ℃冰箱中，备用。

单体花色苷含量测定参考Wang Yu等[26]的方法进行。称取0.500 g葡萄果皮干粉于离心管中，加入10 mL含有2%甲酸的甲醇溶液，避光超声10 min后在摇床中振荡提取30 min，8 000×g离心10 min，转上清液于50 mL离心管中，重复提取3 次，合并上清液在离心浓缩仪浓缩至干，剩余物质用流动相A∶B（9∶1，V/V）定容至10 mL。过0.45 μm有机滤膜后采用1100系列配有二极管阵列检测器的LC/MSD Trap-VL液相色谱-离子阱质谱联用仪进行样品的定性和定量分析。

色谱条件：Kromasil 100-5C18色谱柱（25 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A相为水-甲酸-乙腈溶液（92∶2∶6，V/V）；B相为水-甲酸-乙腈溶液（44∶2∶54，V/V）；洗脱程序：1～18 min，90%～75% A，10%～25% B；18～20 min，75% A，25% B；20～30 min，75%～60% A，25%～40% B；30～35 min，60%～30% A，40%～70% B；35～40 min，30%～0% A，70%～100% B。流动相流速1.0 mL/min；柱温50 ℃。

单体花色苷的定性研究根据文献[27]中的“葡萄与酒花色苷HPLC-UV-MS指纹谱库”进行。花色苷定量以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷为外标物建立质量浓度为5～500 mg/L的花色苷定量回归方程Y=38.548X－106.32，其中Y为峰面积，X为二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷质量浓度，该方程回归系数为0.999 7。

1.3.3 果皮非花色苷酚类物质测定

参考Wang Yu等[26]的方法进行。称取0.500 g葡萄果皮干粉于离心管中，加入1 mL蒸馏水和9 mL乙酸乙酯，摇床中避光振荡30 min，转上清液于50 mL离心管中，重复3 次。合并上清液在离心浓缩仪浓缩至干，残渣用1 mL甲醇定容。采用1100系列LC/MSD Trap-VL高效液相色谱-离子阱质谱联用仪进行分析。

色谱条件：流动相A为0.1%甲酸溶液，流动相B为1%乙酸-乙腈溶液。洗脱程序：0～20 min，90% A，10.0% B；20～30 min，90%～85% A，10%～15% B；30～40 min，85%～80% A，15%～20% B；40～50 min，80%～67% A，20%～33% B；50～55 min，67%～60% A，33%～40% B；55～58 min，60%～0% A，40%～100% B；58～63 min，100% B；63～64 min，90% A，10% B。流动相流速1.0 mL/min；柱温25 ℃。非花色苷酚类物质的定性与定量参考Liang Nana等[27]的方法。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 疏穗处理对葡萄果实理化指标的影响

如表1所示，疏穗处理提高了葡萄果粒质量和果粒横径。随着疏穗量的增加，果实中还原糖含量和可溶性固形物含量增加，总酸含量降低。与CK相比，C1、C2还原糖含量分别提高了6.32%和8.76%，总酸含量分别降低了3.60%和2.85%。

表1 疏穗处理对葡萄果实理化指标的影响Table 1 ffect of cluster thinning on physicochemical parameters of grape berries

表1 疏穗处理对葡萄果实理化指标的影响Table 1 ffect of cluster thinning on physicochemical parameters of grape berries

注：数据为3 个重复的平均值，同行不同小写字母表示差异显著（P＜0.05），下同。

指标 处理CK C1 C2果粒质量/g 1.55±0.16b 1.58±0.19b 1.69±0.16a果粒横径/mm 12.87±0.56ab 12.65±0.82b 13.14±0.67a还原糖质量浓度/（g/L） 194.65±2.86b207.69±7.34a212.44±7.81a总酸质量浓度/（g/L） 5.28±0.12a 5.09±0.01b 5.13±0.04b可溶性固形物质量分数/% 20.70±0.00b 21.10±0.00a 21.10±0.12a总酚含量/（mg/g） 37.40±2.45b 42.74±1.22a 38.80±3.41ab单宁含量/（mg/g） 19.06±2.76c 24.97±6.6a 21.63±0.30b总花色苷含量/（mg/g） 13.09±1.01c 16.67±1.80a 14.62±1.01b

采收期各处理葡萄果实总酚含量存在显著差异，C1、C2总酚含量比CK分别提高了14.28%和3.75%，其中，C1总酚含量显著高于CK。疏穗处理后，葡萄果实中单宁和总花色苷含量均显著升高，与CK相比，C1、C2单宁含量分别提高了31.01%和13.48%，总花色苷含量分别提高了27.35%和11.69%。

2.2 疏穗处理对果皮单体花色苷的影响

表2 疏穗处理对葡萄果皮单体花色苷含量的影响Table 2 ffect of cluster thinning on contents of monomeric anthocyanin in grape skins

表2 疏穗处理对葡萄果皮单体花色苷含量的影响Table 2 ffect of cluster thinning on contents of monomeric anthocyanin in grape skins

类别 单体花色苷含量/（μg/g） 处理CK C1 C2花翠素-3-O-葡萄糖苷delphinidin-3-O-glucoside (Dp) 1 205.92±85.33b 1 311.81±18.98a 1 386.09±14.97a花青素-3-O-葡萄糖苷cyanidin-3-O-glucoside (Cy) 285.45±11.57a 192.32±4.28c 247.45±4.98b基本花色苷甲基花翠素葡萄糖苷petunidin-3-O-glucoside (Pt) 802.47±47.10b 759.69±7.96b 929.35±57.84a甲基花青素葡萄糖苷peonidin-3-O-glucoside (Pn) 665.23±30.50a 678.42±6.03a 761.61±88.37a二甲花翠素葡萄糖苷malvidin-3-O-glucoside (Mv) 5 583.90±82.89b5 784.20±60.18ab5 943.70±153.67a小计 8 542.97±189.92 8 726.44±43.57 9 268.21±164.24比例/% 57.22 55.96 53.24花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)葡萄糖苷Dp-3-O-(6-acetyl)-glucoside 772.59±25.56c 926.24±29.20b 1 644.60±52.14a花青素-3-O-(6-O-乙酰化)葡萄糖苷Cy-3-O-(6-acetyl)-glucoside 135.14±7.60a 132.13±16.40a 107.53±16.05a乙酰化花色苷二甲花翠素乙酰化葡萄糖苷Mv-3-O-(6-acetyl)-glucoside 3 159.37±33.77c 3 476.94±6.14b 3 810.45±9.88a甲基花翠素乙酰化葡萄糖苷Pt-3-O-(6-acetyl)-glucoside 400.69±13.08a 426.62±3.89a 427.91±22.08a甲基花青素乙酰化葡萄糖苷Pn-3-O-(6-acetyl)-glucoside 418.53±15.92a 428.08±1.41a 457.53±61.83a小计 4 886.32±48.88 5 390.00±16.31 6 448.01±57.71a比例/% 32.72 34.57 37.04甲基花翠素咖啡酰化葡萄糖苷Pt-3-O-(6-caffeoyl)-glucoside 21.39±2.37ab 27.90±2.94a 19.35±4.60b咖啡酰化花色苷二甲花翠素咖啡酰化葡萄糖苷Mv-3-O-(6-caffeoyl)-glucoside 88.43±3.85ab 83.92±1.01b 90.83±3.94a小计 109.82±1.47 111.82±1.93 110.18±8.53比例/% 0.74 0.72 0.63

续表2

如表2所示，在3 种处理的皮中均检测出18 种单体花色苷，包括5 种基本花色苷、5 种乙酰化花色苷、2 种咖啡酰化花色苷和6 种香豆酰化花色苷。疏穗处理后葡萄果皮中单体花色苷含量显著升高，C1、C2单体花色苷含量较CK分别提高了4.43%和16.59%。

随着疏穗量的增加，葡萄果皮中花翠素类和二甲花翠素类花色苷含量升高。花色苷B环上游离羟基数目越多，其蓝色色调越深，甲基化数目越多，其红色色调越深[10]。因此，随着疏穗量的增加，‘赤霞珠’葡萄果皮颜色越来越深，说明疏穗处理有利于果实着色。葡萄果皮中非酰化花色苷占总量的53%以上；其次为乙酰化花色苷，占总量的32%～37%；香豆酰化花色苷占总量的9%左右；只有微量咖啡酰化花色苷。非酰化花色苷是所有花色苷中含量最高的组分，疏穗处理后，果皮中非酰化花色苷含量升高，在C2中含量最高为9 268.21 μg/g。与非酰化花色苷相比，酰化花色苷的化学稳定性更强，疏穗处理后，果皮中酰化花色苷所占比例增加。

图1 不同疏穗处理葡萄果皮单体花色苷聚类分析Fig. 1 Cluster analysis of monomeric anthocyanins in grape skins with different levels of cluster thinning

为进一步分析不同疏穗处理葡萄果皮单体花色苷组分的差异，利用RStudio软件进行聚类热图分析，结果如图1所示。18 种单体花色苷被聚为III类。第I类物质包括甲基花翠素咖啡酰化葡萄糖苷、反式-二甲花翠素香豆酰化葡萄糖苷、花青素-3-O-(6-O-乙酰化)葡萄糖苷和花青素香豆酰化葡萄糖苷4 种，在C1中含量较高。第II类物质包括甲基花翠素香豆酰化葡萄糖苷、二甲花翠素葡萄糖苷和花青素-3-O-葡萄糖苷3 种，在C1中含量最低。第III类物质包括甲基花青素葡萄糖苷、甲基花翠素乙酰化葡萄糖苷等11 种，在C2处理中最高。

2.3 疏穗处理对果皮非花色苷酚类物质的影响

表3 疏穗处理对果皮非花色苷酚类物质含量的影响Table 3 ffect of cluster thinning on contents of non-anthocyanin phenolic compounds in grape skins

表3 疏穗处理对果皮非花色苷酚类物质含量的影响Table 3 ffect of cluster thinning on contents of non-anthocyanin phenolic compounds in grape skins

类别 非花色苷酚类物质含量/（μg/g）处理CK C1 C2黄烷醇原花色素B1 procyanin B1 2.44±0.22b 1.15±0.18c 5.10±0.35a棓儿茶素 gallocatechin 2.77±0.05c 3.11±0.01b 4.75±0.10a表棓儿茶素 epigallocatechin 0.50±0.00b 0.51±0.01b 0.72±0.04a儿茶素 catechin 1.784±0.14c 2.22±0.04b 3.61±0.26a原儿茶素 protocatechuic acid 0.06±0.00a 0.06±0.00a 0.10±0.00a表没食子儿茶素没食子酸酯epigallocatechin gallate 1.10±0.00a 1.12±0.01a 1.10±0.01a小计 8.65±0.11 8.17±0.28 15.38±0.48比例/% 1.52 1.29 2.67杨梅酮-半乳糖苷myricetin-galactoside 28.19±0.06b 29.75±0.36a 26.21±0.28c黄酮醇 杨梅酮-葡萄糖苷myricetin-glucoside 126.99±0.30a128.03±1.31a122.02±0.86b槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸酐quercetin-3-O-glucuronide 84.82±0.10c 108.26±0.56a 99.54±0.96b槲皮素-3-O-半乳糖苷quercetin-3-O-galactoside 48.40±0.01b 54.65±0.125a 47.00±0.24c槲皮素-3-O-葡萄糖苷quercetin-3-O-glucoside 158.29±0.14b169.30±0.53a154.89±1.03c鼠李糖素-3-O-葡萄糖苷isorhamnetin-3-O-glucoside 2.64±0.02b 4.06±0.56a 2.31±0.04b槲皮素-3-O-鼠李糖苷quercetin-3-O-rhamnoside 1.08±0.04a 1.95±0.09a 1.28±0.05a山柰酚-3-O-半乳糖苷kaempferol-3-O-galactoside 15.44±0.01b 18.64±0.08a 12.56±0.03c山柰酚-3-O-葡萄糖苷kaempferol-3-O-glucoside 38.64±0.04b 46.62±0.12a 32.63±0.26c杨梅酮 myricetin 1.96±0.04a 1.96±0.09a 1.92±0.22a异鼠李亭 isorhamnetin 0.96±0.00a 0.98±0.05a 1.02±0.00a西伯利亚落叶松黄酮 laricitrin 0.96±0.02b 1.02±0.05a 1.08±0.06b丁香亭-葡萄糖苷syringetin-glucoside 25.03±0.09c 27.04±0.28a 26.32±0.26b丁香亭-半乳糖苷syringetin-galactoside 25.23±0.09c 27.26±0.35a 26.53±0.33b丁香亭 syringetin 0.62±0.01b 0.65±0.06b 0.92±0.08a小计 559.25±0.34 620.17±0.96 556.14±3.46比例/% 98.48 98.71 97.33总计 567.90±0.06b628.34±1.10a571.52±2.98b

从表3可以看出，在3 种处理的果皮中均检测出21 种非花色苷酚类物质，包括6 种黄烷醇和15 种黄酮醇。处理C1和C2非花色苷酚类物质含量较CK分别提高了10.64%和0.64%，其中，C1非花色苷酚类物质含量显著高于CK。

黄烷醇类：各处理果皮中均检测出6 种黄烷醇，分别为原花色素B1、棓儿茶素、表棓儿茶素、儿茶素、原儿茶素和表没食子儿茶素没食子酸酯。不同疏穗处理葡萄果皮中黄烷醇类物质总量存在显著差异，但占非花色苷酚类物质总量的比例均较低，不足3%。

黄酮醇类：黄酮醇占非花色苷酚类物质的比例很高，在97%左右。槲皮素类在黄酮醇中含量最高，约占黄酮醇总量的53%。疏穗处理后，果皮中黄酮醇含量升高，C1黄酮醇含量较CK提高了10.89%，达到差异显著水平，C2黄酮醇含量与CK无显著差异。

图2 不同疏穗处理葡萄果皮非花色苷酚类物质聚类分析Fig. 2 Cluster analysis of non-anthocyanin phenolics in grape skins with different levels of cluster thinning

如图2所示，21 种非花色苷酚类物质聚为5 类，第I类成分包括鼠李糖素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷等7 种非花色苷单体，在处理C1中含量最高；第II类成分包括表没食子儿茶素没食子酸酯、丁香亭-半乳糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸酐、丁香亭-葡萄糖苷4 种，且C1和C2处理组明显高于CK。第III类成分包括异鼠李亭、原花色素B1、表棓儿茶素等7 种，其中C2处理组最高。第IV类成分包括槲皮素-3-O-鼠李糖苷、杨梅酮和西伯利亚落叶松黄酮3 种。

2.4 PCA结果

对不同疏穗处理的葡萄果实基本理化指标和类黄酮物质进行PCA，结果见图3。PC1解释了总变量的45.24%，PC2解释了总变量的28.87%。在图3B中，花色苷和黄烷醇主要集中在PC1正端，黄酮醇主要集中在PC2正端。由图3A可以看出，PC1能将CK与C2很好地区分开，PC2能将CK与C1很好地区分开，说明CK与C2在与PC1相关的物质上差异较大，随着疏穗量的增加，与不疏穗果实花色苷和黄烷醇物质的差异越大。

图3 不同疏穗处理与葡萄果实品质相关物质的PCAFig. 3 Principal component analysis of substances related to grape quality under different levels of cluster thinning

3 结论与讨论

疏穗是一种能有效提高葡萄果实品质的栽培技术手段。有研究指出，疏穗处理后葡萄果实的外观特性和生理指标发生显著变化，包括果粒质量提高、还原糖含量增加和总酸含量降低等[28-29]。本实验结果与前人的研究一致，C1和C2疏穗处理均提高了葡萄果实的果粒质量和横径，增加了果实中还原糖含量，降低了总酸含量。

类黄酮物质是葡萄和葡萄酒重要的质量参数之一，不仅影响葡萄酒的颜色、风味、收敛性和生化稳定性，还影响了葡萄酒的生理活性功能[2,9]。花色苷是葡萄果实和葡萄酒中主要的呈色物质，在本实验中，C1、C2果皮中单体花色苷的含量均显著高于CK，且酰化花色苷的含量和所占比例随着疏穗量的增加而升高，说明疏穗处理对果皮中花色苷有积极影响，与Bogicevic等[30]的研究结果一致。研究者认为这可能是由于疏穗处理有效改善了葡萄植株的叶果比和库源关系以及剩余果实生长的微环境，有利于花色苷的合成和积累[31]。Xi Xiaojun等[21]发现疏穗处理后，夏黑葡萄中编码查耳酮合酶、查耳酮异构酶、类黄酮3’,5’-羟化酶、O-甲基转移酶和类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶等花色苷合成和转运关键酶基因表达量显著上调。黄烷醇的变化趋势与花色苷相似，随着疏穗量的增加，其含量在C2中达到最大值。果皮中黄酮醇含量随疏穗量的增加先升高后降低，处理C2和CK黄酮醇含量均显著低于C1，说明疏穗量过大反而不利于黄酮醇的积累。刘迪迪等[32]也得出相似的结论，这可能是由于疏穗量过大导致植株营养生长旺盛，消耗了大量的养分或者叶幕郁闭，不利于果实品质的提高[33]。

本研究表明，27%和54%疏穗处理均可以提高果粒质量和还原糖含量，降低总酸含量，有利于葡萄果皮类黄酮物质的积累。综合各处理类黄酮物质含量和成本因素，建议山西省乡宁地区疏除27%果穗为宜。