郫县豆瓣智能后发酵工艺优化及品质分析

刘 平，王雪梅，向 琴，孙文佳，李亚隆，李佳釔，陈志伟，车振明

（西华大学食品与生物工程学院，四川 成都 610039）

郫县豆瓣被誉为“川菜之魂”，是川菜中必不可少的辣味调味品，其味辣香醇、红棕油亮、黏稠绒实、酱香浓郁的特色，在世界“发酵辣椒酱”中独一无二[1]。酿造郫县豆瓣有3 个重要阶段：甜瓣子发酵、椒醅制作、甜瓣子与椒醅混合后的后发酵。其中，后发酵是郫县豆瓣产生风味的关键阶段。

郫县豆瓣传统后发酵工艺采用天然晒露法，目前企业基本采用该法[2]，发酵过程主要依靠郫县地区优越的地理以及气候环境，极有利于多种微生物生长繁殖和多种酶系充分而完全的酶解作用。发酵生产主要在水泥条池和陶瓷缸中实现，在“翻晒露”后发酵工艺中，除部分较大企业使用单独的翻搅机实现“翻”外，其余各工艺环节均以人工操作为主。该法发酵周期长、人力消耗大、卫生条件不易控制、产品质量稳定性低、生产成本高、对气候的依赖度较大，并且存在季节性生产[3]。同为传统发酵调味品，酿造酱油已实现全过程机械化、密闭化生产，所生产的酱油成本低、品质高[4]。酿造米醋[5]也实现了自动化液态深层发酵，提高了米醋风味品质，并使得陈酿期的安全性得到保障。舒杰[6]研制的镇江香醋固态发酵自动化监测与翻醅控制系统，能控制醋醅温度并远程监测，实现自动化、科学化翻醅。但是郫县豆瓣在机械化、自动化、清洁化生产上与酱油、醋还有较大差距，一方面郫县豆瓣发酵机理还未明晰，另一方面颠覆传统生产模式需要更多智能生产方面的研究。

本研究以模拟传统自然后发酵“翻晒露”为基础，利用自主设计研发的“郫县豆瓣智能生产设备”进行发酵。采用单因素试验，通过理化指标对发酵参数进行优化，并在此基础上全面跟踪评价智能后发酵豆瓣品质优劣，为自动化后发酵的产业化应用和加工工艺的规范提供理论依据和技术参数。相比传统发酵模式，设备旨在实现郫县豆瓣后发酵工艺的全程可控，保障产品的质量与安全，缩短发酵周期，提高生产效率。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

成熟甜瓣子与椒醅均取自四川省郫县豆瓣股份有限公司；邻二氯苯（纯度99.0%）、C6～C20正构烷烃标准品西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；柠檬酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、乳酸、草酸、甲醇、乙醇（均为优级纯） 上海源叶生物科技有限公司；甲基红、溴甲酚绿、酚酞、亚甲蓝指示剂 成都科龙化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

PHS-320显数式pH计 成都世纪方舟科技有限公司；K9860全自动凯氏定氮仪 济南海能仪器股份有限公司；WFJ7200分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司；SB-5200DTN超声清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司；GCMS-QP2010 Plus气相色谱-质谱联用仪日本岛津仪器公司；固相微萃取手动进样手柄、75 μm CAR/PDMS萃取头 美国Supelco公司；L-8900日立全自动氨基酸分析仪 中国天美科学仪器有限公司；e2695高效液相色谱仪 美国Waters公司；VG3S025涡旋混匀器德国IKA公司；TD-5M台式低速离心机 四川蜀科仪器有限公司。

“郫县豆瓣智能生产设备”由本团队自主设计研发[7]，装置图如图1所示。设备由郫县豆瓣酱搅拌机、升降机、倒料架、支架、升降传动机构、门、气缸、调节支架、增湿机、加热器组成，带有自动化操作界面，能够设置多种自动控制系统。在郫县豆瓣后发酵过程中，环境的温度、湿度、光照和含氧率等会影响微生物的生长代谢以及酶的作用，从而影响郫县豆瓣的质量。故设备采用温度与湿度传感器精准感应发酵环境的温湿度，并利用加热器、增湿机、搅拌机、模拟光源对环境温湿度、搅拌频率、光照条件进行控制。为方便进出料和清洗，设备的升降机、滑动滚轮和外置推动气缸三者完美结合：首先利用升降机将发酵罐运送至中层，保证中层有5 个独立的发酵罐，然后利用气缸和滚轮协同作用将料缸推出发酵柜体，此时即可进行进料或中途取样；若整个发酵结束后，需要将物料全部取出和彻底清洗，可借助出料感应系统，插上出料缸的插头即可自动、充分地倾倒出物料，并利用配套的高压水枪进行及时清洗。

图1 郫县豆瓣智能生产设备图Fig. 1 Schematic diagram of the automatic equipment for Pixian broad-bean paste post-fermentation

1.3 方法

1.3.1 郫县豆瓣智能发酵条件优化

表1 郫县豆瓣智能后发酵条件优化Table 1 Protocols to optimize post-fermentation conditions of Pixian broad-bean paste

取成熟甜瓣子与椒醅，按质量比3∶7混合，在“郫县豆瓣智能生产设备”中进行后发酵，具体设置如表1所示。每隔10 d取一次样，连续测定3 个月，动态监测后发酵过程中理化指标，包括氨基酸态氮、可溶性氮、总酸、还原糖含量，以及特征挥发性风味物质的变化规律，并以此为衡量标准进行条件优化。

1.3.2 郫县豆瓣智能发酵与自然发酵对比实验

利用优化后的最佳工艺参数进行智能发酵，取智能发酵1、2、3 个月，共3 个时间节点，并依次编号A-1M、A-2M、A-3M；作为对比，取自然发酵0 d和1、2、3、4、5、6、9、12 个月，共9 个时间节点，并依次编号T-0D、T-1M、T-2M、T-3M、T-4M、T-5M、T-6M、T-9M和T-12M。取样方式参照已有报道[2,11]，尽量保证所取样本的代表性和均匀性，样品于－80 ℃保存备用。

1.3.3 理化指标测定

总酸采用酸碱滴定法[12-13]测定；氨基酸态氮采用甲醛滴定法[14]测定；还原糖采用直接滴定法[15]测定；水分采用直接干燥法[12]测定；盐分采用硝酸银滴定法[12-13]测定；游离氨基酸采用Lin Hongbin等[16]方法测定；有机酸采用于筱雨等[17]方法测定。

pH值测定：准确称取5.00 g剁碎样品，加入50 mL蒸馏水，保鲜膜封口，室温搅拌浸提1 h，滤纸过滤后用pH计测定。

色价参考马嫄等[18]的方法测定：采用丙酮超声法提取色素，利用紫外分光光度计测定上清液在460 nm波长处的吸光度。

可溶性氮采用凯氏定氮法[19]测定：取样品与蒸馏水按质量比1∶4均匀混合，40 ℃水浴搅拌提取1 h，室温4 000 r/min离心15 min，测定上清液中蛋白质含量，即可溶性氮含量。

1.3.4 挥发性风味物质测定

在Liu Ping等[12]方法上略作修改，采用固相微萃取-气相色谱-质谱法。称取5.00 g样品于顶空瓶中，加入10 μL 10 μg/mL邻二氯苯-甲醇溶液，60 ℃水浴平衡30 min后，用萃取头吸附30 min，在气相色谱进样口解吸。

气相色谱条件：色谱柱采用Agilent HP-5石英毛细管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；进样口温度240 ℃，不分流进样；柱箱升温程序：35 ℃保持5 min，以2.5 ℃/min升至115 ℃，以10 ℃升至200 ℃，最后200 ℃保持4 min。

质谱条件：电子电离源，温度和能量分别为200 ℃和70 eV，质量扫描范围m/z35～500。

挥发性组分定性定量参考已有研究方法[12,20]。首先，将各组分的质谱碎片模式与NIST17 Library谱库进行比对，选择SI≥80的组分进行初步定性；其次，根据相同气相色谱条件下正构烷烃标品的保留时间计算各组分的保留指数，并与相关文献报道进行比对，进一步辅助定性。最后，根据离子流色谱峰面积归一化法对各组分进行定量，即根据各组分与内标物的峰面积之比等于其物质浓度之比。

1.3.5 感官评价

感官评价方法、评分标准及计算公式参考Liu Ping等[12]的方法，从滋味（口感、鲜味、咸味、酸味、甜味、苦味、辣味）、香味（香味度、持续性、协调性）、色泽（亮泽度、色度、均匀度）、外观（均匀度、完整度、杂质）等方面进行感官评价，总体得分经过加权处理，计算公式：

总分=0.4×滋味得分＋0.3×香味得分＋0.15×色泽得分＋0.15×外观得分

1.4 数据处理

采用Excel 2016对实验数据进行处理和图形绘制。

2 结果与分析

2.1 智能发酵条件优化

2.1.1 搅拌频率对郫县豆瓣后发酵品质的影响

由图2a可知，不同搅拌频率下，氨基酸态氮质量分数均维持在0.200%水平以上，达到一级豆瓣的质量要求[21]，但整体香气不足；随发酵时间的延长，其含量呈先缓慢降低后缓慢升高的趋势，发酵100 d含量约为初始值的1.4 倍。可溶性氮质量分数基本维持不变，变化范围在0.511%～0.679%之间。可溶性氮通常为氨基酸态氮、游离氨基酸和某些小分子肽类等，可通过微生物代谢产生的蛋白酶降解蛋白质产生[22]。在后熟生香阶段，某些含氮物质会发生自我降解，或与体系中其他物质发生化学反应而被消耗，如谷氨酸通过脱氨、脱羧或氧化形成琥珀酸[22]；或与还原糖发生美拉德反应形成挥发性风味物质和呈色物质[23]。由此，整个后熟期间可溶性氮的形成速率和消耗速率持平。

图2 搅拌频率对郫县豆瓣理化指标和特征风味物质的影响Fig. 2 Effects of stirring frequency on physicochemical properties and characteristic flavor compounds in Pixian broad-bean paste

由图2b可知，总酸含量呈不规律波动，一方面酵母菌和乳酸菌等微生物生长代谢产生有机酸使得总酸升高[3]，另一方面，有机酸自我挥发或与醇类物质发生酯化反应使得总酸降低[22]，当两者速率相近时即形成相对平衡状态。还原糖含量在整个发酵阶段持续下降，发酵末期降幅高达70%，说明微生物生长代谢旺盛，葡萄糖等碳源物质消耗增加，此时豆瓣酱香风味物质逐渐累积。根据郫县豆瓣现有标准，氨基酸态氮含量的高低通常标志着产品质量的优劣，因此，通过氨基酸态氮含量能够比较客观地筛选较优搅拌频率。比较分析发现，搅拌2条件下的氨基酸态氮和可溶性氮整体趋势均高于搅拌1，而总酸和还原糖含量无明显差异。其原因可能在于：搅拌加大了酱醅和空气接触的机会，微生物生存环境中的氧气含量增多，于是好氧菌迅速增殖（如乳酸菌），厌氧菌急剧凋亡（如醋酸杆菌、乳酸菌、酵母菌）[8]。高产蛋白酶的微生物占据优势后迅速增殖，不断降解蛋白质，使得氨基酸态氮和可溶性氮持续累积。

前人研究鉴定出26 种郫县豆瓣特征风味物质[23-24]，本研究在此基础上进行挥发性风味物质评价。由图2c可知，对比不同搅拌频率的特征风味物质组成及含量，发现搅拌2条件下香气化合物明显丰富且浓度偏高，进一步说明该发酵条件能够在一定程度上促进豆瓣后熟风格的形成，加快后熟进程。因此，选择较优搅拌条件为搅拌2，即搅拌1 次/d、1 min/次。

2.1.2 光照对郫县豆瓣后发酵品质的影响

2.1.2.1 光源的选择

图3 光源对郫县豆瓣理化指标和特征风味物质的影响Fig. 3 Effects of light sources on physicochemical properties and characteristic flavor compounds in Pixian broad-bean paste

如图3a所示，随着发酵时间的延长，氨基酸态氮和可溶性氮质量分数缓慢升高，分别由发酵初期的0.280%和0.598%升至0.380%和0.673%。在图3b中，总酸质量浓度变化幅度相对较小，基本维持在0.30 g/100 mL左右。还原糖质量分数逐渐降低，发酵末期约降至发酵初期的30%～36%。由图3c可知，特征风味物质检出个数先减少后逐步趋于稳定，总含量先逐渐减少后增加，而后急剧减少，最后达到相对平衡。比较不同光源条件，发现总酸和氨基酸态氮含量无明显差异。然而，荧光灯照射条件下，还原糖质量分数下降速率略大，发酵结束时下降约64%；LED灯光源下降了58%。还原糖消耗速率快，可能是由于发酵体系中的微生物在迅速生长，也可能是还原糖与其他物质反应加速形成了风味[23]，因此，光照在一定程度上加速了酱醅的成熟。在荧光灯照射下可溶性氮的变化范围为0.511%～0.636%，LED灯下为0.577%～0.673%；发酵结束时，LED灯条件下其含量比荧光灯高，表明LED灯照射能使含氮化合物累积更多，其中可能包括某些呈味肽等，这也侧面反映出豆瓣呈味效果可能更好[25]。此外，整个后发酵期间特征风味物质的含量在不同光源下无明显区分；但发酵40 d后，LED灯照射下的香气化合物丰富性增加，整体风味更加协调柔和；发酵90 d，特征风味物质个数达到荧光灯的2 倍。综上，两种光源对酱醅理化品质的影响程度较小，可基本忽略，这一结果与前人研究较为一致[9]；但考虑到豆瓣整体香气的协调性，LED灯模拟日光似乎略有优势，具体原因有待进一步研究。因此，本研究后续分析暂选用LED灯，以探究光照时间和光照强度对郫县豆瓣品质的影响。

2.1.2.2 光照时间的选择

从图4a可以看出，氨基酸态氮质量分数在发酵前80 d呈动态波动，基本维持在0.20%～0.33%，之后累积速率急剧升高，发酵末期接近0.40%。此外，无光条件下可溶性氮含量的整体趋势均高于有光条件，发酵末期高达0.679%；24 h光照下仅0.630%。图4b显示，总酸呈不规律波动，但幅度较小，可忽略。发酵前30 d，还原糖消耗速率急剧加快，但不同光照时间下无明显差异；发酵30～70 d过程中，不同光照时间下还原糖均维持在0.65%左右，消耗速率和生成速率逐步达到平衡。值得注意的是，在图4c中，随着酱醅曝光时间的延长，特征风味物质的含量差距越来越小，但其个数差距逐步拉大，无光条件下风味物质种类显著偏高。由于某些波段的光束可能会造成稳定性差的化合物分解，也可能影响发酵体系中产香菌的生长代谢，导致风味物质合成受阻[9]，故光照0 h（即无光照）更有助于加快郫县豆瓣后发酵过程中独特风味的形成。

图4 光照时间对郫县豆瓣理化指标和特征风味物质的影响Fig. 4 Effects of illumination time on physicochemical properties and characteristic flavor compounds in Pixian broad-bean paste

2.1.2.3 光照强度的选择

图5 光照强度对郫县豆瓣理化指标和特征风味物质的影响Fig. 5 Effects of light intensity on physicochemical properties and characteristic flavor compounds in Pixian broad-bean paste

由图5a、b可知，在不同光照强度下，可溶性氮、总酸和还原糖含量差异不明显，但在发酵60 d后，无光条件下的氨基酸态氮累积含量略高。图5c显示，在后发酵20～60 d过程中，特征风味物质个数及含量的差异越来越明显，且无光条件下物质种类更为丰富，化合物浓度更高；继续发酵时，这种差异有逐步缩小的趋势。因此，选择较优的光照强度条件0 只灯（即无光照），这也进一步验证了上述光源和光照时间筛选得出的结论。综上，光照对郫县豆瓣理化品质的影响十分微小，这一结论与前人在酱油中的研究结果较为相似[9]；而光照可能会加快郫县豆瓣呈香物质的形成速度，但这种影响相较于传统晒露工艺优势，将在后文进行阐述。

2.1.3 环境温度对郫县豆瓣后发酵品质的影响

发酵郫县豆瓣需经历夏季的“三伏天”，利用“三伏天”的温度为微生物提供生长繁殖代谢的有利环境。有研究表明，郫县豆瓣发酵过程中的优势菌群不仅能代谢产生独特风味，它的次级代谢产物还能对发酵体系中的腐败杂菌起到抑制作用[26]。在郫县豆瓣后发酵体系中，当环境温度达到微生物最适生长温度时能够迅速增殖，当达到最适代谢温度时能够迅速积累代谢产物，寻找微生物生长和代谢的最佳环境温度对指导实际生产具有重要意义。郫县豆瓣的功能菌主要为乳酸菌和酵母菌，其最适生长温度分别为30～40 ℃和25～30 ℃[8]，本研究在此基础上探究不同环境温度下各理化指标的变化，结果如图6a、b所示。在不同温度下，理化指标无显著差异，无法通过理化指标筛选较为合理的发酵温度。然而，40 ℃持续高温发酵时，发酵体系中水分散失速率明显加快，酱醅表面极易形成干壳，酱体颜色偏黑色或棕褐色，散发出浓烈的焦糊味和蒸煮味，感官上比较难以接受。相比之下，28 ℃时酱醅的补水频率减少，所得酱体色、香、味的整体风格与传统发酵豆瓣最为接近。进一步特征香气物质测定结果如图6c所示，发酵前30 d，34 ℃的环境温度更有利于特征香气化合物种类的保留；而继续发酵时，不同温度下特征风味物质的检出个数越来越接近，最后基本维持在同一水平。另外，28 ℃保温环境下，香气物质的含量略高于其他温度条件，原因可能在于高温环境不适合某些产香微生物的生长代谢，当温度超过其耐受温度范围时会出现不同程度的消亡。因此，本研究选择最佳发酵温度为28 ℃。

图6 环境温度对郫县豆瓣理化指标和特征风味物质的影响Fig. 6 Effects of temperature on physicochemical properties and characteristic flavor compounds in Pixian broad-bean paste

2.1.4 环境湿度对郫县豆瓣后发酵品质的影响

在28 ℃保温发酵时，若环境湿度较低，则发酵体系中水分散失较快；要保证酱醅黏稠度一致，则需要相应补水，故每隔10 d进行一次补水，以保证酱醅的湿润状态。由图7可知，在不同湿度下，各项理化指标及特征风味物质的变化均无特定规律，因此，通过“露”弥补散失水分并未造成理化指标的差异，故后续实验选择自然室内湿度。

图7 环境湿度对郫县豆瓣理化指标和特征风味物质的影响Fig. 7 Effects of environmental humidity on physicochemical properties and characteristic flavor compounds in Pixian broad-bean paste

2.2 智能后发酵郫县豆瓣的质量评价

2.2.1 不同后发酵条件下理化指标的变化规律

利用2.1节优化的智能发酵工艺参数进行发酵，即：无光照、28 ℃持续保温、自然湿度环境下发酵，且每天翻搅1 次、每次翻搅1 min。动态监测后发酵过程中郫县豆瓣品质的优劣，并将其与工厂中传统自然发酵样品进行比较分析，结果如图8所示。

智能后发酵过程中，由于补水量较多，酱醅含水量显著高于自然发酵样品，发酵3 个月时约高出4%，也因此体系含盐量轻微偏低。水分和盐分质量分数随发酵时间的延长维持在相对稳定水平，发酵前3 个月水分保持在60%左右，盐分约为18.0%，后续发酵应注意适当控制补水量，以保证最终产品符合行业标准[21]。智能发酵豆瓣与自然发酵豆瓣的色价存在明显差异，但均随发酵时间的延长而逐渐下降。发酵3 个月，智能发酵样品色价值为0.630±0.026，约为自然发酵样品的1.24 倍，可见无光保温环境下豆瓣色泽较深。原因可能在于辣椒中红色素在无光条件下稳定性较好，并且恒温环境能够促进美拉德反应形成色素。总酸和pH值的整体变化趋势与自然发酵相同，智能发酵1～3 个月过程中，总酸缓慢增加，pH值持续下降。值得注意的是，智能发酵豆瓣的总酸质量浓度显著高于自然发酵，且发酵1 个月已经高达（0.73±0.04）g/100 mL，远超自然发酵12 个月的（0.61±0.04）g/100 mL，酱醅具有明显的酸味，甚至有掩盖豆瓣酱香味的趋势，感官欠佳。由于酱醅含水量高、发酵环境空气流速低以及搅拌次数偏少，导致体系中的溶氧量减少、酱醅与环境空气的接触减少，乳酸菌等厌氧菌生长代谢旺盛，使智能发酵体系中有机酸的累积速率加快。但有机酸的累积必须控制在适宜范围，过多有机酸会导致酱醅发酸变质[27]。故为保证产品具有良好的风味，在后续智能发酵过程中应适当降低体系含水量或加快发酵环境的空气流速，让多余的有机酸充分挥发。未考虑通过增加搅拌次数使有机酸挥发，是因为搅拌容易破坏蚕豆瓣子和椒醅的完整性。

图8 智能发酵与自然发酵郫县豆瓣的相关理化指标Fig. 8 Physicochemical indexes of Pixian broad-bean pastes produced by intelligent fermentation and natural fermentation

智能发酵豆瓣除了酸类物质累积更快外，还原糖消耗速率、氨基酸态氮及可溶性氮生成速率均显著高于自然发酵豆瓣。在1 个月时，智能发酵豆瓣的还原糖质量分数仅为（1.060±0.007）%，降幅超过30%，继续发酵，还原糖呈缓慢波动式下降。由此表明，智能发酵过程中，还原糖的消耗阶段集中在发酵前1 个月，此后由于体系中大量酸类物质的积累，使得酶活力降低并引起耐酸能力较弱的微生物逐渐消亡[3]，还原糖的生成速率降低。同时，在恒温发酵体系中，还原糖与其他物质反应生成风味组分的速率加快[23]，两者速率不断变化并逐渐达到平衡状态，此时还原糖含量基本维持恒定水平。

与之相反，智能发酵豆瓣氨基酸态氮含量持续增加，增加速率先快后慢，发酵1 个月后质量分数从（0.36±0.007）%升高至（0.41±0.012）%，约为发酵初期的1.5 倍，且智能发酵豆瓣的氨基酸态氮显著高于传统发酵全过程。由此表明，采用保温发酵能够激发氨基酸态氮的累积，缩短发酵周期，为进一步提高豆瓣质量提供了可能性。可溶性氮含量在前发酵1 个月过程中迅速增加，质量分数从（0.598±0.07）%升高至（0.652±0.03）%，累积量甚至高于传统发酵12 个月含量水平，继续发酵，含量略有降低，但仍保持在0.650%水平以上，同样表明智能发酵有利于含氮化合物的累积，可能包括氨基酸态氮、多肽等，后续将继续进行分析。

2.2.2 不同后发酵条件下有机酸的变化规律

图9 智能发酵与自然发酵的郫县豆瓣中有机酸含量的变化Fig. 9 Changes in organic acid contents of Pixian broad-bean pastes produced by intelligent fermentation and natural fermentation

自然发酵过程中，有机酸的变化并不明显，故只将前3 个月的样品进行对比。在智能发酵郫县豆瓣中，利用高效液相色谱法检出6 种有机酸。由图9可知，在前3 个月发酵阶段，总有机酸含量变化趋势与自然发酵一致，均随发酵的进行不断累积。但智能发酵保温条件下增速更快，发酵1 个月总有机酸含量高达（5.360±0.224）mg/g，这一结果与总酸和pH值测定结果相吻合。原因可能在于：1）智能发酵体系中较高的含水量与低频率的翻搅，使酱醅中含氧率降低，再加上温度适宜，均有利于乳酸菌、醋酸菌等厌氧产酸微生物的生长代谢[8,27]；2）发酵罐置于不锈钢柜体中，酱醅表面空气流速低，不利于有机酸的向外挥发[27]。

智能发酵样品中所检出的有机酸种类、分布及变化规律与自然发酵样品的检出情况极为相似。草酸由于检出含量低于0.01 mg/g未在图中出现，其检出结果与已有研究存在差距[16-17]。柠檬酸占比仍居第一，含量高达3.860 mg/g以上，且随着发酵时间延长呈缓慢增加趋势，在0～3 个月期间，智能发酵与自然发酵无明显差异。其次是苹果酸（＞0.520 mg/g），累积阶段集中在前发酵1 个月，智能发酵1 个月时，其累积量已达到0.521 mg/g；继续发酵，累积速率略有下降；发酵3 个月后，含量超过了0.700 mg/g，远超自然发酵的含量水平。由此说明，智能发酵比自然发酵更能促进苹果酸的产生和累积，原理与总有机酸含量偏高类似，但有机酸累积过多会抑制酱醅中某些产酸微生物[28]，使得有机酸增速减小。酒石酸（＞0.710 mg/g）作为郫县豆瓣中的第三大有机酸，也在前发酵1 个月累积，发酵1 个月结束时，含量约为发酵初期的2.7 倍，其智能发酵含量均远超自然发酵。乳酸和琥珀酸在后熟期间的变化情况则相对较小，智能发酵3 个月，含量分别为（0.122±0.003）mg/g和（0.172±0.002）mg/g，仅比自然发酵3 个月高出0.034 mg/g和0.041 mg/g。

综上，智能发酵过程中，苹果酸、酒石酸、乳酸和琥珀酸的加成效应使总有机酸含量增加，当有机酸含量在适宜的范围内增加时能够促进郫县豆瓣的呈味，一旦产酸过量则会引起酱醅酸败，因此在后续利用该设备生产时需采取措施避免酸类物质过量累积。

2.2.3 不同后发酵条件下游离氨基酸的变化规律

由于游离氨基酸在自然发酵3 个月之后逐渐达到平衡，故只选用前3 个月的样品进行比较。如图10所示，智能发酵样品中，除检出17 种氨基酸和2 种酰胺类物质外，半胱氨酸（Cys）也有检出，含量约为0.050～0.170 mg/g，这在自然发酵样品中没有检出。智能发酵阶段，总游离氨基酸含量变化范围为18.203～21.027 mg/g，均显著高于自然发酵样品。发酵1 个月含量最丰富，约为自然发酵的1.4 倍；继续发酵，含量呈现相似的动态下降趋势，降幅低于自然发酵。此外，苦味、甜味、鲜味氨基酸含量变化范围分别为6.548～7.618、5.670～6.418、5.581～6.663 mg/g，均显著高于自然发酵样品，且随着发酵的进行均缓慢降低，降幅同样低于自然发酵样品，这表明智能发酵的呈味效果可能更好。

图10 智能发酵与自然发酵的郫县豆瓣中游离氨基酸种类与含量Fig. 10 Types and concentrations of free amino acids from Pixian broadbean pastes produced by intelligent fermentation and natural fermentation

由图10可知，在所检出的游离氨基酸中，含量大于1.000 mg/g的氨基酸共9 种，除自然发酵检出的5 种高含量氨基酸谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、精氨酸（Arg）、脯氨酸（Pro）和天冬酰胺（Asn）外，还包括呈甜味的丙氨酸（Ala）、赖氨酸（Lys）以及呈苦味的缬氨酸（Val）和亮氨酸（Leu），总占比高达70%，各氨基酸含量高低排序依次为：Glu、Asp、Arg、Pro、Leu、Lys、Ala、Val、Asn。随着发酵的进行，Glu和Asp的含量逐渐增加，Pro、Asn、Arg和Val的含量逐渐减少，Ala、Lys和Leu的含量基本维持在发酵1 个月的水平，这些变化趋势与自然发酵极为相似，但自然发酵的各氨基酸发生急剧变化的时期均集中在前发酵1 个月；继续发酵，智能发酵的变化速率略低于自然发酵。智能发酵3 个月，Asn含量偏低，约0.042 mg/g，其余8 种氨基酸的含量均高达自然发酵的2 倍。此外，甲硫氨酸（Met）含量随发酵的进行不断降低，由发酵1 个月0.219 mg/g下降至发酵3 个月的0.155 mg/g，此时约为自然发酵样品的1.5 倍。其余低含量氨基酸，包括苏氨酸（Thr）、丝氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、组氨酸（His）、异亮氨酸（Ile）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe），除在1 个月时累积量高达自然发酵的2 倍外，整个后熟初期基本维持在恒定水平。值得注意的是，智能发酵样品中还检出Cys，且随发酵的进行持续增加。

综上所述，利用智能发酵设备进行无光、保温发酵能够显著增加酱醅的游离氨基酸含量，原因可能在于保温发酵为微生物增殖和多种酶系作用提供了良好的外部环境，使产物迅速累积，有助于酱醅后熟风味的形成。

2.2.4 不同后发酵条件下挥发性风味物质的变化规律

表2 不同后发酵工艺郫县豆瓣特征风味物质比较分析Table 2 Comparative analysis of characteristic volatile flavor compounds of Pixian broad-bean pastes prepared by different post-fermentation processes

通过固相微萃取-气相色谱-质谱法测定智能发酵样品与自然发酵样品前3 个月的挥发性风味物质，定性定量结果见表2，自然发酵样品中检出的风味物质种类明显更多，但智能发酵样品中风味物质含量显著偏高，尤其是特征风味物质。两种发酵方式样品的香气化合物均为酯类、醇类、醛类、酮类、酚类、酸类、烃类和其他杂环物质。风味物质种类较多的依次为酯类、烃类、醇类、醛类，酚类物质的种类数最低；含量较高的组分为醇类（14.7%～22.8%）、酯类（24.4%～43.1%）和酚类（16.8%～38.9%）。随着智能发酵的进行，醛类和酮类化合物的种类和含量逐渐减少；酯类、醇类、酚类、酸类和烃类化合物的种类变化较小，含量逐渐增加；而其他化合物的种类逐渐增加，但含量不断减少。比较智能发酵与自然发酵对郫县豆瓣挥发性风味物质的影响，发现自然发酵样品的香气物质种类更为丰富，在后发酵1～3 个月，除酚类和酸类的种类数基本相同外，其他化合物的种类数均显著高于智能发酵样品。发酵3 个月，自然发酵样品的种类数高达137 种，比智能发酵样品多28 种。由此说明，自然发酵更有利于郫县豆瓣挥发性物质的生成及保留。值得注意的是，尽管自然发酵样品中香气化合物更丰富，但浓度和阈值才是决定其对郫县豆瓣风味贡献大小的重要因素。智能发酵样品中，醛类和酮类化合物的含量均显著偏低，发酵3 个月，醛类仅为自然发酵样品的43%，而其他各类化合物的含量均显著偏高。由表2可知，特征醛类物质在自然发酵样品中的种类略多，含量持续累积；在智能发酵样品中，含量基本恒定。其他特征物质的种类在两种发酵方式下基本相同，但智能发酵中的含量显著偏高，尤其是醇类和酸类物质。

酯类化合物作为郫县豆瓣风味中种类最丰富的组分，总量基本维持在500 ng/g以上水平。随发酵的进行，酯类物质含量持续累积，且智能发酵样品的累积速率明显较快。发酵3 个月结束时，酯类物质总量约为自然发酵样品的1.24 倍，其中特征酯类组分含量更高，如十六酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、异戊酸乙酯等。智能发酵的无光保温条件使有机酸和醇类物质更加丰富，增大了酯化反应的底物浓度，使郫县豆瓣的酯香味更加浓郁，这与前人研究结论相似[9]。

醇类化合物是郫县豆瓣风味中较重要的组分，许多醇类物质除本身具有愉悦的花果香外[24]，还能与酸类物质发生酯化作用，促进郫县豆瓣酯香成分的生成。在智能发酵过程中，醇类物质含量持续增加，发酵3 个月含量为自然发酵样品的1.44 倍，其中特征醇类组分的含量也急剧上升，3-甲硫基丙醇、芳樟醇、苯乙醇含量分别从5.192、62.062、188.256 ng/g升至21.366、174.679、413.056 ng/g，分别为自然发酵样品的2.2、3.8、1.8 倍。在自然发酵过程中，太阳光的紫外线可能会对某些微生物的生长代谢产生一定抑制作用，尤其是与醇类化合物产生有关的酵母菌等的生长活动[9,29-30]，因此自然发酵的醇类物质没有智能发酵的含量高。

醛类化合物也是郫县豆瓣香气的重要贡献者，性质极活泼，易被还原为相应的醇[24,31]，其含量变化情况在2 种发酵方式中呈完全相反的趋势。随着发酵的进行，自然发酵样品中醛类物质含量持续增加，由初期的146.712 ng/g增至185.125 ng/g，而智能发酵样品中则不断降低，降幅高达46%。此外，比较特征醛类组分发现，苯甲醛、苯乙醛、壬醛、3-甲硫基丙醛在发酵3 个月时，自然发酵样品中的累积量分别为智能发酵样品的3.8、2.3、3.6、2.9 倍。由此说明，光照在一定程度上能够促进醛类物质的生成，其途径可能通过紫外线促进氨基酸与水之间的反应[30]。醛类物质虽是酱香味的主要来源，但浓度并非越高越好。有研究表明，3-甲硫基丙醛和苯乙醛在啤酒中的含量与其质量呈负相关，在长期贮藏的啤酒中因其含量高而导致啤酒产生老化风味[32]。

酚类、酸类化合物在智能发酵中，含量也显著偏高，发酵过程中累积速率明显较快。酚类物质通常被鉴定为发酵制品的重要香气化合物，如4-乙基愈创木酚和4-乙基苯酚，其形成同样与酵母菌等微生物有关[33]。智能发酵过程中，酚类含量持续增加，其中特征酚类组分4-乙基苯酚在历经3 个月发酵后，含量约为传统发酵样品的1.6 倍。同时，适宜的酸类物质在一定程度上能促进酯香成分生成，并协调整体呈味风格；但酸类物质累积过量极易产生不愉悦的刺激性酸味，其形成主要与乳酸菌和酵母菌的代谢活动有关[9,28]。智能发酵样品中酸类物质含量为自然发酵样品的2.6 倍，且特征酸类组分异戊酸仅在智能发酵样品中检出，这均表明智能发酵极大程度上促进了产酸微生物的代谢，体系酸性物质过量累积，使得酸味成为郫县豆瓣的主导风味，严重影响了郫县豆瓣的品质。

此外，杂环化合物中的吡嗪和吡咯类物质，因其易挥发、香气强、低阈值而成为郫县豆瓣的特征香气组分，主要在甜瓣子发酵阶段形成，在后熟期间浓度有所下降，并逐步形成酱香风格。比较发现，2,5-二甲基吡嗪、四甲基吡嗪在智能发酵中的累积量分别为自然发酵的2.8、5.6 倍，因此智能发酵能够在一定程度上加速郫县豆瓣特征风味形成进度。

综上所述，自然发酵的传统翻晒露发酵工艺和智能发酵的无光保温发酵工艺各有优缺点，前者的挥发性物质种类更加丰富，发酵成品的整体风味更加协调、柔和，而后者虽能促进大部分特征风味物质形成（醛类物质除外），但会造成体系中过量酸类物质积累，严重影响整体感官品质。

2.2.5 不同后发酵类型的感官评价

对智能发酵与自然发酵3 个月的样品进行感官评价。如图11a所示，两种样品均表现出咸味适中、辣味适中、不甜不苦的滋味特征。但智能发酵样品口感更加细腻，原因可能在于智能发酵设备搅拌更加均匀充分；同时，智能发酵样品鲜味较足、酸味较重，说明智能发酵能够促进鲜味氨基酸与有机酸的形成与累积，该结论与游离氨基酸、有机酸的测定结果相吻合，但突出的酸味感受并不是优质郫县豆瓣的特征。如图11b所示，两种样品香味持久度相当，相比之下，智能发酵样品风味更加浓郁，但其酸味过重使得整体风味呈现出不协调感，因此智能发酵在香味上的感官评分与自然发酵持平。从色泽上看，两种样品均呈现出光亮晶润、颜色均匀的特点，但智能发酵样品所表现出的油亮的深褐色，与郫县豆瓣的特征色更加接近，这与色价测定结果一致，故智能发酵样品色泽得分略高。而无论是智能发酵样品，还是自然发酵样品，从外观上看均呈现出形态完整、酱体均匀、没有杂质的状态，故外观得分相同。总体来看，智能发酵样品的感官评分略高于自然发酵样品。

图11 智能发酵与自然发酵郫县豆瓣的感官评分Fig. 11 Sensory scores of Pixian broad-bean pastes produced by intelligent fermentation and natural fermentation

3 结 论

利用自主设计的智能发酵设备，模拟传统“翻晒露”工艺进行后发酵，采用单因素试验对发酵工艺参数进行优化，根据氨基酸态氮、可溶性氮、总酸和还原糖含量等理化指标和特征风味物质的检出情况进行筛选，最终确定最优发酵条件为：搅拌1 次/d、1 min/次，无光照，28 ℃持续保温，自然室内湿度。

在此基础上进行智能发酵，并与自然发酵样品比较，发现智能发酵样品的含盐量偏低，含水量、色价值、总酸含量较高，还原糖消耗速率、氨基酸态氮及可溶性氮生成速率较高，发酵周期缩短。对有机酸、游离氨基酸挥发性风味物质进行对比分析，发现智能发酵促进了郫县豆瓣中有机酸的增加，有利于含氮化合物的累积，增加了酱醅中游离氨基酸含量，能够促进大部分特征香气物质形成（醛类物质除外），但会造成体系中过量酸类物质积累，影响整体感官品质；而自然发酵的挥发性物质种类较丰富，酿造成品的整体风味更协调。因此，在后续研究中需对酸类物质进行控制，避免累积过量。