意识障碍动物模型制作的研究进展

刘 倩，孙伟铭，冯 珍

(南昌大学a.第一附属医院康复医学科； b.第一临床医学院，南昌 330006)

近年来随着医疗水平的不断提高，颅脑损伤救治水平不断提高，大量危急患者被抢救成功，但是很多患者因长期脑组织缺血、缺氧、坏死等进一步诱发脑神经元变性坏死，最终导致神经功能丧失而形成意识障碍(disturbance of consciousness，DOC)，表现为患者对外界刺激失去反应，包括运动和感觉功能，只保留自主神经系统功能的状态[1]，给患者家庭和社会带来了极大负担。目前，从临床诊断和鉴别的角度出发，意识障碍可以区分为脑死亡(brain death,BD)、昏迷(coma)、植物状态(vegetative state,VS)、最低意识状态(minimally conscious state,MCS)等类型[2]。

由于意识障碍的类型多样，致病机制较复杂，实验研究和临床治疗显得尤为重要。以人作为试验对象来研究疾病在时间、空间上存在诸多局限性，且在方法和伦理上受到限制。因此医学实验常用动物模型作为试验基础。借助于动物模型，可以突破以上研究的局限性，获得条件一致且数量庞大的实验材料，能更准确地获得实验结果并与人类意识障碍进行比较研究，更方便有效地研究人类意识障碍的原发性、继发性损伤机制以及生理病理过程，为诊断和治疗提供依据。动物模型建立的最终目的是防治疾病，而疾病模型研究结果的可靠程度取决于模型与人脑意识障碍的相似性或可比性[3]。选择合适的动物模型将有助于实验研究的进行。本文就国内外常用的意识障碍动物模型的建模方法和模型评价作一综述。

1 自由落体撞击法动物模型

经典“自由落体撞击法”是较早用于制作意识障碍动物模型的方法，即重物在动物上方的滑竿中自由落下，撞击头部致脑损伤，构建意识障碍动物模型。

1981年FEENEY等[4]设计了自由落体撞击致脑损伤模型。2004年高燕等[5]改进FEENEY的自由落体模型装置，采用电磁铁释控开关自由落体模型，以不同冲击力(200 g×cm、600 g×cm、1000 g×cm)致大鼠轻、中、重度脑损伤，证实脑组织出现不同程度的改变，与致力伤大小成正比。2009年宋扬等[6]在此模型的基础上做了一些改进，使大鼠头部受已知重量的自由落体撞击致脑损伤，发现所有创伤组均见明显、广泛的蛛网膜下腔出血，符合脑损伤改变。证明了本体系可用于建立和量化评价大鼠创伤性脑损伤情况。陈琴等[7-8]利用改进后的自由落体撞击法成功地建立了大鼠意识障碍模型，证明了正中神经电刺激(median nerve electrical stimulation,MNES)和经颅直流电刺激(transcranial direct current stimulation,tDCS)可改善脑损伤(traumatic brain injury,TBI)后昏迷大鼠的意识状态水平。

自由落体撞击法动物模型主要是通过加速型脑损伤模拟临床上的局限性脑挫裂伤，该模型损伤明显、部位局限，症状恢复慢，非损伤区脑组织无明显损伤，可用于研究局限性脑挫裂伤造成的意识障碍[9]。

2 冲击加速性动物模型

冲击加速性动物模型对自由落体撞击法进行改进，通过增加泡沫垫和铁盘来保证外力负荷的瞬时性和弥漫性，模拟闭合性直线加速颅脑损伤，是一种在垂直面上的直线加速打击致颅脑损伤的意识障碍模型。

1994年MARMAROU等[10]对自由落体撞击法模型进行改进，用于研究延长性昏迷和弥漫性轴索损伤。方法是动物俯卧于海绵平台上，在颅骨表面的正中放置有槽金属圆盘，重物自上方滑杆中垂直落下撞于圆盘上引起颅脑损伤。2000年王君宇等[11]对MARMAROU的实验装置进行改进，建立弥漫性轴索损伤合并局灶性脑挫伤模型。在骨窗相适应的位置的垫片上加一个圆柱状突起，产生广泛的弥漫性轴索损伤，又可将打击力度直接作用到硬膜上产生局灶性脑挫伤。2006年张继东等[12]采用改进的MARMAROU致伤模型建立家兔直线加速型脑损伤合并尺骨骨折模型，致伤后家兔未见颅骨骨折，脑组织外观无局灶性挫裂伤改变，行病理组织学检查证明为弥漫性脑损伤。

此模型的优点是同时具备冲击和加速度，损伤机制与临床实验的致伤机制相吻合，且不易出现直接冲击硬膜导致的脑干伤，血压变化小，死亡率低，便于对致伤机制加以研究。

3 液压冲击颅脑损伤动物模型

液压冲击法是常用的建立动物意识障碍模型的方法。该模型在颅骨钻孔处，运用已知重量的流体冲击完整的硬脑膜，使压力传递至硬膜下空间，导致传递性的弥漫性脑损伤，被广泛用于研究颅脑损伤机制。

1966年LINDGREN等[13]最先利用液压冲击法建立兔的颅脑损伤模型。1987年DIXON等[14]设计了大鼠液压冲击致脑损伤模型，利用压力传感器测出脑组织所承受的压力，以复制轻、中、重度颅脑损伤动物模型。2000年张永亮等[15]对该模型进行改进，建立大鼠分级侧位液压冲击脑损伤模型，精确地控制冲击气压的大小，并在冲击后能很快释放装置内的压力，使脑组织不受再次损伤，发现侧位液压冲击脑损伤随冲击压力的增加而加重，以冲击侧大脑半球为最重，也可波及对侧及脑底部。2016年金卫蓬等[16]采用3种液压冲击力建立小鼠液压冲击脑损伤模型，发现打击力度与小鼠脑损伤程度、死亡率及脑挫裂伤灶和MRI影像学改变成正比。2017年吴志宝等[17]利用液压冲击脑损伤大鼠模型，观察了脑损伤核因子E2相关因子2-抗氧化反应元件通路的时程表达变化。

液压冲击损伤模型的优点为可精确地复制分级的脑损伤，可用于研究颅脑损伤病理、分子病理、生物力学、死亡原因及法医学鉴定；缺点为可引起神经源性肺水肿、脑桥和延髓损伤致动物死亡[18]。

4 惯性加速性脑损伤动物模型

惯性加速性脑损伤动物模型是因头部挥鞭样或加速性旋转运动形成的剪应力造成神经轴索损伤的动物模型，显微镜下可见神经轴索断裂、轴浆溢出、轴浆运输受损甚至中断[19]。方法是直线或旋转外力作用于与实验装置固定联动的动物头部，造成头部的挥鞭样或加速性旋转运动而导致神经轴索损伤。

1982年GENNARELLI等[20]利用该方法建立了惯性加速损伤动物模型，将狒狒头部与气动和链锁装置联动，使狒狒头部做60°的角形加速运动，发现狒狒出现了持续性的意识丧失，且存在弥漫性轴索损伤。2000年SMITH等[21]对加速损伤装置进行改进，发现延长性昏迷主要是因为脑干部位轴突发生弥漫性损害。国内设计的电机驱动的托盘式加速机，发现以角加、减速度瞬时旋转60°～80°作用于动物后，可造成3～4 h的持续性脑昏迷[22]。

此模型的缺点为大型动物较易引发弥漫性轴索损伤，小型动物的动物模型复制更困难，死亡率高；优点为模型的致伤机制为加速性损伤，没有冲击因素，对运动可较好地控制。目前，瞬间加速性旋转模型在弥漫性轴索损伤研究中代表性最强、应用最广泛。

5 颅脑爆炸脑损伤动物模型

颅脑爆炸伤模型是动物头颅受爆炸冲击波作用后，脑干及高级中枢受到冲击损伤制作的动物意识障碍模型，可用于研究爆炸性武器冲击波及碎片作用于大脑所致的脑损伤。

2000年SUNESON等[23]用猪进行颅脑爆炸伤实验，观察到伤后动物均出现心率减慢、呼吸暂停等脑干抑制现象。2007年高波等[24]建立了犬颅脑爆炸伤模型，将爆炸球分别悬于距致伤动物右颞顶部不同但适当距离处，采用点爆炸源对犬的右颞顶部进行不同距离的爆炸。2016年郭运林等[25]制作了新西兰大白兔改良爆震伤模型，证明该方法可制作稳定重型颅脑爆震伤。

该模型可模拟冲击波原发效应，致伤因素单一，且炸药能量或动物致伤物距离可调节，稳定性好，重复率高且操作安全，可用于临床颅脑爆炸伤的实验研究。缺点是震荡区与挫伤区边界不清，易引发颅内血肿，死亡率高。

6 放射性颅脑损伤动物模型

放射性动物颅脑损伤模型是在动物清醒或麻醉状态下，进行头颅的放射性照射后造成脑损伤制作的动物意识障碍模型。

2003年邢诒刚等[26]在将大鼠麻醉后成功地建立了大鼠放射性颅脑损伤的动物模型。方法为：将大鼠麻醉后，俯卧于60CO治疗机治疗床，在一定的源皮距下照射，结束后取脑组织行病理组织学检查。2004年王琛等[27]在大鼠清醒情况下建立大鼠放射性脑损伤模型，使用“热记忆膜固定罩”，给予大鼠全脑照射，并用剂量仪测量所吸收的剂量。2018年张慧民等[28]用直线加速器进行脑部照射22 Gy后制作放射性颅脑损伤模型，观察葡萄籽原花青素对放射性脑损伤大鼠学习能力及生长相关蛋白(GAP)-43的表达；符桢琳等[29]建立了放射性脑损伤模型，放射组小鼠予60CO γ射线照射。放射前、后分别检测血浆中的纤维蛋白原含量，发现放射可致血浆中纤维蛋白原升高，沉积于脑组织的纤维蛋白原可能是继发性脑损伤的原因。

该动物模型制作方法操作简便，可重复率高，照射剂量确定，可排除麻醉药物等其他因素的干扰，适用于放射性颅脑损伤的研究。

7 脑冷冻伤动物模型

脑冷冻伤模型模拟的是人脑挫伤，主要引起血管源性的脑水肿，是常用的颅脑损伤动物模型[30]。

2001年郭伟等[31]对杨氏[32]模型进行改良，成功地建立了大鼠的脑冷冻伤实验模型，发现神经元病理改变与伤后时间的延长密切相关，证明伤后局部脑组织微循环障碍、供血不足是诱导大脑神经细胞发生变性坏死的主要原因。2007年陈世文等[33]将大鼠用盛有液氮的冷冻杯行硬脑膜外冷冻，伤后行病理检查，发现神经细胞周围出现水肿，神经元变性、坏死，神经、胶质细胞出现空泡样变。证明了脑冷冻伤动物模型的稳定可靠性。

脑冷冻伤动物模型为硬膜外冷冻法，定位准且操作简单，冷冻时间确定，效果一致，可重复性好，符合脑外伤后病理生理改变。

8 光化学诱导法意识障碍动物模型

化学诱导法是通过使用特定的冷光源照射动物脑特定部位，引起化学反应形成血栓，造成动物大脑皮层损伤、皮质下结构相对完整的动物意识障碍模型。

WATSON等[34]首先用光化学诱导法建立了脑梗死模型。2004年周薇等[35]用光化学诱导法建立了大鼠皮质微血栓模型，具体方法为：在大鼠股静脉注射红玫瑰B后，使用能量确定的冷光源照射大鼠脑部特定部位，造成照射部位大脑皮质的血管内形成血栓，进而相应的皮层发生缺血性梗死，最终形成意识障碍。2012年杨峰等[36]用光化学法诱导建立大鼠局灶性脑梗死模型，发现梗死区域神经细胞发生变性、坏死，符合局灶性脑梗死的病理变化。

光化学诱导法建立意识障碍动物模型方法简便，梗死程度稳定，可重复性好，死亡率低，可用于制作进一步临床研究的意识障碍动物模型。

9 立体定向电解法脑损伤模型

立体定向电解法是通过电流毁损动物的中脑网状结构造成意识障碍的实验方法。2000年常鹏飞[37]等以不同强度的电流损毁猫中脑网状结构，造成其不同程度的昏迷。2001年韩震[38]等用中脑被盖绝缘电极插入损毁的方法，造成了大鼠不同程度意识障碍。具体方法为：大鼠吸入异氟醚麻醉后置于SN-Ⅲ型立体定位仪上，参照Paxinos等图谱，选择中脑被盖部3个座标点先后用直径0.2～0.3 mm、尖端裸露0.8～1.2 mm 的绝缘毁损电极插入，通以阳极直流电(6 V，1.5 min)，进行电解毁损。

电解损伤模型的优点在于定位准确，致伤参数可调节，可重复性好、经济适用。缺点是电解损毁易引起机械性损伤，以及高热和辐射造成局部、周围组织损伤，脑组织的受损范围较电解涉及区域大，且死亡率较高。

10 缺氧缺血性脑损伤模型

血管缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是由于各种原因诱发脑血管栓塞引起脑组织缺血缺氧，进一步诱发脑神经细胞变性、坏死,最终导致神经功能障碍丧失的一类疾病[39]。

2007年吴志强等[40]参照LONGA等[41]的方法并加以改进，通过线栓法成功制备了Wistar大鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)局灶性脑缺血模型。2006年潘兴华等[42]建立猕猴的血管缺血性脑损伤模型，将栓子运送到大脑中动脉使动脉分支栓塞，诱导缺血性脑损伤的发生。发现病变特点与临床表现一致，该模型可靠、稳定，可用于急、慢性治疗研究及相关的基础理论研究[30]。2008年贾小兵等[43]通过用改良后的四血管阻塞法加“针控线拴法”，建立了大鼠缺血性昏迷模型，为进一步研究缺血性昏迷动物的促醒实验提供了较好的实验模型。2017年宋红花等[44]通过双线结扎大鼠左侧颈总动脉制作HIBD模型，探讨新生大鼠HIBD模型的制作和早期鉴定。张丹等[45]对经典Vannucci法进行改进，行小鼠左颈总动脉结扎，按照C1—C8条件缺氧建模，证明了该方法是用于新生儿缺血缺氧性脑损伤研究较为理想的动物模型。

HIBD模型的优点为不用开颅且缺血、再灌注时间可控。但实验操作上受许多因素影响，如动物体重、线栓粗细、插线深度及操作技术等；且该动物模型存在制作难度较大、成功率低，易继发血栓形成、蛛网膜下腔出血等缺点。

11 小结

意识障碍类型多样，致病机制复杂,动物模型的基本要求是：1)具有较好的可调控性；2)可操作性好；3)可重复性、再现性好；4)经济适用。意识障碍动物模型的制作方法繁多，模型适用领域不同且各有利弊。意识障碍的恢复是不可预测的，虽然临床研究取得了重大进展，但仍然受到高变异性、有限的数据输出和缺乏必要控制的阻碍[46]。本文讨论了建立TBI诱导的意识障碍模型的方法及评价，研究者可根据实验目的选择合适造模方法，亦可对现有模型进一步改进，寻找新造模方法。