超声靶向微泡破坏技术介导基因转染的研究进展

张 月 周厚妊 辛 莹 李诗慧 刘小奇 刘治军

近年来，随着分子生物学技术和现代医学影像学的快速发展，其结合产物——分子影像学逐渐成为研究热点。超声分子影像学作为一重要组成部分，具有特异性高、敏感性强、安全、无创、方便等优点，亦成为当前分子影像学领域的研究热点。超声靶向微泡破坏（ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD）技术随着时代的发展而出现，为疾病的治疗增加了更多选择。本文就UTMD技术介导基因转染的研究进展进行综述。

一、UTMD的主要作用机制

UTMD是将生物活性物质或治疗基因注入或掺入微泡中并输送至血液循环，最终在超声的作用下破坏微泡并将其释放到靶组织或靶器官的技术［1］。该技术可向特定部位发射不同强度的超声波，当超声强度足够大时血液中的微泡便会发生破裂，破裂后的微泡产生微射流和冲击波，促使周围的血管壁或细胞膜表面出现可逆或不可逆的小孔，增加了血管或细胞膜的通透性，也增加了外源性物质到达特定部位的剂量，从而发挥其特有的生物学效应［2］。其中，最主要的是空化效应，也是UTMD发挥作用的主要机制［3］，UTMD诱导的空化效应又分为稳定空化和惯性空化，两种空化方式对细胞有不同的生物学改变。在稳定空化条件下，微泡的机械振动和体积变化不仅可以通过离子浓度改变细胞膜电位，还可以对细胞膜产生剪切力，刺激细胞内吞，从而促进跨细胞膜基因的转运；惯性空化也会引起细胞膜电位的变化，不仅可产生瞬时剪切力，还能对细胞产生强烈的冲击和热效应，破坏细胞膜的完整性。与稳定空化相比，惯性空化诱导了更大尺寸的膜孔形成，实现了大分子物质的转运。

二、UTMD与其他载体联合使用介导基因转染

1.UTMD与脂质体联用：脂质体是人工合成的双层磷脂囊泡，因其具有类细胞膜结构、高生物相容性、低免疫原性、能保护药物或活性基团、延长药物半衰期及增效减毒等优势，已成为有效传递活性生物化合物的一种有前途的载体。虽其具有转染效率低、表达时间短等缺点，但上述不足均可联合UTMD应用得到解决。外源性质粒DNA要进入细胞核，就必须与包涵体解离，而脂质体介导的基因转染最重要的限速步骤正是如此。研究［4］表明，UTMD产生的空化效应是UTMD联合脂质体介导基因转染的主要机制，也是其提高脂质体转染效率的主要原因。Xu等［5］分析UTMD联合脂质体提高效率的原因：①脂质体虽对质粒DNA有良好的包封率，但部分仍可能在脂质体外；②转染后仅小部分DNA可从包涵体中释放，而空化作用可促进其释放；③细胞有清除外源性物质的能力，部分DNA可被细胞通过胞吐作用排出，空化作用产生的冲击波和微射流可在一定程度上抑制细胞的胞吐作用，提高脂质体的转染效率。Chen等［6］发现辅酶Q10-脂质体联合UTMD显著增强了辅酶Q10在肾脏中的特异性分布，可能是预防糖尿病肾病发生的潜在策略。

2.UTMD与外泌体联用：外泌体是由细胞分泌的纳米级磷脂双层囊泡，可以通过携带多种生物大分子如RNA、DNA、蛋白质等在细胞间传递信息，介导多种生理和病理功能，亦被视为是一种非常有前途的药物载体。然而，心脏、脂肪组织及骨骼肌对外泌体具有耐药性，在治疗上提高这些组织或器官的药物传递效率，可能扩大外泌体的潜在应用范围。Sun等［7］研究表明，UTMD诱导产生的空化效应可以瞬间破坏微血管系统，增加了外泌体在心脏、脂肪组织等耐药器官中的浸润，UTMD作为一种新的组织特异性基因传递手段，可使外泌体进入心脏、脂肪和肌肉组织，为这些器官或组织的基因治疗带来了希望。

3.UTMD与聚合物胶束联用：聚合物胶束是通过嵌段共聚物的自组装而形成的核壳型纳米粒子，由于其尺寸、稳定性、药物掺入效率及释放速率等关键特性均可以通过设计嵌段共聚物来调节，因此是最具前途的纳米载体之一［8］。UTMD与聚合物胶束的结合会带来一种全新的疾病检测模式，研究［9］报道根据超声与聚合物胶束相互作用机制的不同，可将超声介导的聚合物胶束药物递送分为两种：一种是基于超声波对胶束的物理破坏和有效载荷的可逆释放，另一种是基于胶束超声机械化学破坏和载荷的不可逆释放。Wu等［10］成功研制出具有超声反应特性的新型载姜黄素的聚合物胶束，并发现其能显著抑制肿瘤生长。

4.UTMD与病毒载体联用：转染效率高、表达持续的病毒载体是将治疗基因输入靶细胞的最常用工具。但病毒载体自身存在毒性且缺乏特异性，常会引起免疫副反应［11］。UTMD与病毒载体结合具有协同作用，可以改善病毒载体的不足。微泡通过超声辐射提高了特定部位释放的强度，进而提高了病毒载体的特异性；UTMD通过空化作用产生的微射流可以增强细胞膜和毛细血管的穿透性，克服内皮屏障；此外，微泡可以对病毒引起的免疫应答施加限制，允许静脉注射作为传递方式，因此掺入微泡中的病毒载体可允许血管内给药和重复注射［12］。UTMD不仅提高了病毒载体的效率，还避免了病毒载体的免疫原性，使病毒载体能更好地应用于临床。Li等［13］发现单独应用重组腺相关病毒血清2型转染到人肾细胞癌的效率很低，但联合UTMD可将病毒转移效率提高2～3倍，病毒基因组DNA提高9倍以上，且不会降低细胞活力，表明UTMD可与重组腺相关病毒血清2型联合用于癌症的基因治疗。

三、UTMD在疾病治疗中的应用

1.肿瘤：UTMD作为一种新兴的基因传递方式，其介导自杀基因的转染亦是一种极具前景的肿瘤治疗技术［14］。单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦（HSV-TK/GCV）系统是目前最成熟有效的自杀基因疗法，TK基因是药敏基因，肿瘤细胞转染该基因后，对前体药物丙氧鸟苷或无环鸟苷变得敏感，故能被杀死［15］。Zhou等［16］研究结果表明UTMD技术介导HSV-TK基因的转染能有效抑制小鼠卵巢癌。王玲等［17］制备了载HSV-TK基因脂质纳米微泡，表明载HSV-TK基因的纳米微泡联合UTMD对甲胎蛋白阳性的肝癌细胞有明显抑制作用。

2.心血管疾病：Shentu等［18］研究表明，利用UTMD可成功转染血管内皮生长因子基因至心脏，并以P-选择素为靶向部分提高了转染效率，血管内皮生长因子的成功表达增加了心肌血管密度，改善了缺血心肌功能。Cui等［19］研究表明UTMD与核定位信号联合构建的亲核传递系统促进了治疗基因在犬心肌梗死模型中的表达，有效地增加了血管生成，提高了转染效率。Huang等［20］发现通过UTMD下调肾脏G蛋白偶联受体4型表达可以降低自发性高血压大鼠的血压。

3.关节炎：Wang等［21］建立了胶原诱导的关节炎大鼠模型，发现UTMD能显著提高肿瘤坏死因子受体基因转染大鼠肌肉和滑膜炎症的效率，改善关节炎症状，降低滑膜组织和外周血炎症因子水平。Xiang等［22］也发现UTMD可提高增强型绿色荧光蛋白基因在抗原诱导关节炎兔模型体内的转染效率，有望成为一种安全有效的非病毒基因转染治疗关节炎的方法。

4.其他：Wan等［23］研究证明UTMD与聚乙烯亚胺联合应用能提高人视网膜色素上皮细胞和SD大鼠视网膜内质粒DNA的基因表达，且无明显的组织损伤。Xiang等［24］研究证实UTMD可以同时将胰岛素样生长因子-1cDNA和转化生长因子-βshRNA转染至损伤大鼠的跟腱，提高基因转染效率，且联合转染可以改善肌腱的生物力学性能，为肌腱损伤的基因治疗提供了依据。

四、小结与展望

UTMD作为基因治疗中一种全新的工具，具有毒性小、非免疫原性强、操作简便等优点，是一种发展前景极佳的治疗技术。但目前UTMD的临床应用仍存在挑战，如何最大限度地在提高基因转染效率的同时又使其对组织损伤的程度达到最小，如何更好地提高微泡的包载能力、优化超声参数和超声频率依然是亟需解决的问题。随着科技的进一步发展和超声微泡性能的改善，相信今后UTMD可以在人类疾病的诊疗中发挥重要作用。