从物质-代谢-毒性关联视角多维度解析雷公藤复方配伍“异类相制”减轻肝损伤机制

周学平，周玲玲，朱华旭，冯哲，谢彤，陆艳，王婧，付玲

(1.南京中医药大学第一临床医学院，江苏 南京 210023；2.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023)

雷公藤TripterygiumwilfordiiHook.f.是治疗风湿病常用药物，临床疗效确切，备受国内外学者的关注，但临床常见肝、肾、生殖系统等毒副作用[1-2]，尤以肝毒性为多，居单味中药首位[3]。因此，如何降低其毒性而不影响疗效，是临床应用中亟待解决的难题。

对雷公藤减毒的研究，已从剂型改革、结构修饰和中药配伍等多方面开展[4-6]。中药复方的增效减毒是中医药的特色和优势，已有的临床和实验研究均提示：复方配伍减毒可能是实现雷公藤合理用药目的的主要途径，但目前的研究多为选择相应功效的中药对抗毒副反应[7-8]，缺乏与治疗疾病时理法方药的紧密联系，更少上升至中医药理论的研究。

清络通痹方(雷公藤复方)是国医大师周仲瑛教授的经验方，治疗类风湿关节炎安全有效。本团队从长期的临床应用中得到启示，创新性提出“异类相制”配伍减毒理论，认为有毒中药通过与不同性味、不同功效中药的合理配伍，以调其偏性、制其毒性，能减轻或消除毒性，又可全面兼顾病情、增强药效[9]。近年来本团队以清络通痹方(雷公藤、生地、三七、僵蚕、青风藤)为载体，选择临床常见的肝毒性为切入点，开展系列探索研究，从物质-代谢-毒性关联视角多维度解析雷公藤复方配伍“异类相制”减轻肝损伤机制。

1 雷公藤代谢性肝损伤特点及复方配伍减毒效应

采用大、小鼠等不同动物及L-02、HepG2、HepaRG等肝细胞株，将雷公藤与清络通痹复方中不同功效药物分别配伍进行干预，结合含药血清和主要活性组分(雷公藤甲素、三七总皂苷、梓醇)，通过多种体内、外研究发现：一定剂量的雷公藤或其主要毒性成分雷公藤甲素可引起动物肝组织和肝细胞损伤，出现肝功能指标异常，肝脏过氧化指标改变，肝细胞坏死、水肿、脂肪变性和炎细胞浸润等；糖脂代谢产物水平升高；肝细胞亚细胞结构损伤，线粒体膜破坏、嵴断裂、空泡变性，内质网减少、断裂。研究也发现，雷公藤复方或复方组分配伍均能有效改善上述异常改变，尤以清络通痹全方效果最优，雷公藤分别配伍三七、生地效果次之[10-12]。

团队的研究结果提示雷公藤肝毒性与代谢存在一定的关联。因此，拟从代谢角度研究复方配伍减轻雷公藤肝毒性的机制。

2 复方配伍减轻雷公藤肝毒性的机制

肝脏是重要的代谢解毒器官，也是糖类及脂质代谢的主要场所。毒性剂量的雷公藤可能通过改变外、内源性代谢(药物自身代谢和肝脏糖脂代谢)过程导致肝损伤，复方配伍不同功效的药物可能从不同途径影响代谢过程，从而发挥减毒效应。

2.1 复方配伍调节雷公藤自身代谢和肝脏糖脂代谢而发挥减毒效应

2.1.1 调节雷公藤自身代谢 雷公藤毒性成分主要是二萜内酯类成分(雷公藤甲素等)，其次是生物碱类(雷公藤碱等)，二者同时又是主要药效成分。团队采用指纹图谱及指标性成分含量测定方法研究了复方配伍前后雷公藤中上述化学成分的变化情况，结果发现复方配伍后无新的化合物产生，雷公藤甲素等二萜内酯类和生物碱类成分在水提取液中的含量均有所降低，尤以全方及配伍三七、生地较为显著。上述结果证明了复方配伍使雷公藤中毒性成分呈缓慢溶出的特征，改善了配伍前的“突释”现象，这可能是雷公藤复方配伍减毒的机制之一[13-14]。

进一步采用清络通痹全方、雷公藤分别配伍方中各药，给予模型动物后发现，全方及各配伍组中雷公藤甲素的最大血药浓度(Cmax)下降，半衰期(T1/2)延长，作用时间也相对延长；雷公藤甲素在肝脏、肾脏中的分布均有下降趋势，代谢时间延长。上述结果证明了雷公藤通过配伍三七、生地等药，可显著降低毒性[15]。该过程可能是由于配伍使得雷公藤甲素等毒性成分在治疗域内吸收强度减弱、作用时间相对延长，从而起到了控释和缓释调节作用。

2.1.2 调节肝脏糖脂代谢 团队的研究发现，雷公藤所致的肝损伤多伴有糖类及脂质代谢异常，如生化指标血糖、血脂异常，基因芯片检测显示糖脂代谢相关基因表达改变等[16]。进一步由气质联用代谢组学及液质联用代谢组学平台，分析雷公藤配伍前后大鼠血浆和肝组织代谢谱的变化。结果显示复方配伍使机体的代谢谱发生了变化，全方能够纠正雷公藤引起的肝损伤，雷公藤分别配伍生地、三七的作用次之。三七和生地可能是通过纠正机体的氨基酸代谢和脂肪酸代谢发挥配伍减毒作用[17-18]。分析代谢通路的关键代谢酶，发现雷公藤产生肝毒性主要来源于机体内脂肪酸水平的升高[19]，复方配伍可使肝组织中升高的脂肪酸水平降低。

研究结果表明：雷公藤可同时影响机体的外、内源性代谢，复方配伍可通过调节雷公藤引起的外、内源性代谢变化而发挥减毒效应。配伍减毒效应的实现与影响雷公藤药物代谢过程和内源性代谢相关，且以调节内源性糖脂代谢为主。

2.2 复方配伍通过调节肝脏代谢酶减轻雷公藤肝毒性

肝脏代谢酶在外、内源性代谢过程中均发挥着重要的作用，其中细胞色素P450(CYP450)酶活性对Ⅰ相代谢的降解反应起着决定性作用；葡萄糖醛酸转移酶(UGT)是Ⅱ相代谢时最重要的一种酶，可使毒性物质解毒失活。

为了解雷公藤肝损伤过程中肝脏代谢酶的变化和复方配伍对上述变化的影响，团队建立了CYP450同工酶温孵体系和超高效液相色谱-质谱联用分析方法，发现毒性剂量的雷公藤可导致肝内CPY3A、CYP2C9、CPY2C19酶活性的下降，全方组大鼠肝脏CYP450含量显著升高；酶促动力学研究表明，三七改善雷公藤抑制CYP3A的作用较明显，而生地改善雷公藤抑制CYP2C19的作用较明显[10,20]。配伍三七、青风藤调节UGT1A1和UGT1A6的表达，配伍三七、僵蚕增加UGT2B7在内质网中的表达[21]。

上述对大鼠肝脏Ⅰ/Ⅱ相代谢酶的分析提示，复方配伍可能通过对药物代谢酶及多种亚酶活性、表达和定位的调节，减轻雷公藤肝毒性。

2.3 复方配伍调控核受体-代谢通路减轻雷公藤肝毒性

核受体是一组转录调控因子，一类为药物代谢性核受体，如孕烷X受体(PXR)、组成型雄烷受体(CAR)等；一类为糖脂代谢性核受体，如过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)、肝X受体(LXR)、法尼醇X受体(FXR)等。核受体在机体药物代谢、药物解毒过程及糖脂代谢调控中起着重要作用。

2.3.1 复方配伍调控核受体-代谢通路的主要靶点 本团队采用基因芯片技术筛选及分析雷公藤复方配伍前后差异基因，发现其与CYP450酶、PPAR等核受体、脂肪酸延长等有关。雷公藤可下调CYP8B1、CYP2E1、CYP2C、CYP2B等代谢酶基因的表达，清络通痹方可上调CYP3A4、CYP2E1、CYP8B1等代谢酶基因的表达。PCR进一步验证，清络通痹方可逆转雷公藤导致的大鼠肝脏核受体PXR、CAR、PPAR转录水平的降低[16]。

2.3.2 复方配伍调控核受体-代谢通路减轻肝细胞损伤的机制 团队分别研究了PXR、CAR[22-23]等核受体在雷公藤肝毒性中的角色及对外、内源性代谢的调控作用，在此基础上探索复方配伍减轻肝毒性的机制。研究发现雷公藤复方组分配伍可影响CAR的表达，进一步诱导CYP3A4、CYP2C9、UGT1A6等Ⅰ/Ⅱ相代谢酶，促进雷公藤自身代谢。研究表明调控核受体-代谢网络是复方配伍减毒的重要机制之一，不同功效药物作用的靶点存在差异，复方配伍通过多靶点、多通路作用实现网络性调控效应是“异类相制”减毒的分子生物学基础。

2.4 复方配伍调节肝细胞自噬和凋亡减轻雷公藤肝毒性

雷公藤干扰代谢可诱发线粒体和内质网应激，其在细胞自噬激活和凋亡机制中起着重要作用，雷公藤极性代谢产物亦可引起肝细胞线粒体损伤、氧化应激，影响细胞自噬和凋亡。

团队研究中发现，毒性剂量的雷公藤能够激活氧化应激诱导细胞自噬，这可能与机体的保护机制相关，随着雷公藤甲素浓度的持续增加，过度自噬可诱导肝细胞凋亡，导致肝细胞损伤[24]。而复方配伍三七、生地或其活性组分可减轻雷公藤引起的过度自噬，从而起到减毒作用。

研究还发现配伍的活性组分主要通过调节核转录因子Nrf1/2的表达，影响Nrf1下游线粒体转录因子A(TFAM)和细胞色素C(Cyt-C)，降低线粒体损伤和细胞凋亡[12]；增加Nrf2下游基因NQO1和HO-1转录，增强抗氧化酶的抗氧化作用，从而保护线粒体；且多种组分组合比单一组分效应更明显[11]。可进一步从肝细胞自噬和凋亡着眼，深入探讨复方配伍减轻雷公藤毒性的关键机制。

3 “异类相制”理论的传承与创新

3.1 “异类相制”是传统方药配伍理论基础上的创新

中药配伍理论及组方原则肇始于《神农本草经》《素问》，《神农本草经·序例》云：“若有毒宜制，可用相畏、相杀者，不尔勿合用也”；《素问·至真要大论》谓：“主病之谓君，佐君之谓臣，应臣之谓使”，古代医家则总结归纳为“七情”和“君、臣、佐、使”。其中“七情”配伍中的“相畏”“相杀”是指一种药物的毒副作用能被另一种药物所抑制；或一种药物能减轻另一种药物的毒性。而传统“君、臣、佐、使”制方中的佐制药可消除或减弱君、臣药的毒性，或制约君、臣药峻烈之性。可见相畏、相杀和佐制药配伍均能起到减毒作用。临床实践和科学研究表明：复方组成中起到配伍减毒的并非仅为佐药或两味药间的“相畏”“相杀”，而是由多种药物的交互协同或拮抗作用，达到既增效而又减毒的目的。传统的中药“七情”和方剂配伍理论已难以完全解释诸多方药配伍的解毒作用，“异类相制”是基于临床实践在传承中医方药配伍理论基础上的创新。

3.2 “异类相制”理论内涵的现代阐释

不同功效药物(生地、三七、僵蚕、青风藤)与雷公藤配伍，能降低雷公藤毒性物质溶出，影响其体内过程；调节药物代谢酶，逆转脂质代谢的异常，也可调节代谢酶基因表达及肝脏核受体转录水平，通过调控核受体-代谢酶减轻雷公藤肝毒性；并调控Nrf1-线粒体途径、Nrf2-抗氧化途径，改善脂质过氧化损伤、线粒体损伤和肝细胞过度自噬与凋亡，从而起到保护肝脏的作用。配伍减毒效应以全方作用最佳，配伍生地、三七次之。

药物的性味与功效密切相关，分析复方的药物组成，归纳“异类相制”配伍减毒的方式主要有性味相制、异效相制、扶正制毒，且在组方中每多交互相呈。清络通痹方中雷公藤祛风除湿、活血通络、消肿止痛；生地滋阴补肾，益肾即可养肝；三七活血化瘀，“祛瘀生新”，尚有补血之功；青风藤祛风湿，通经络；僵蚕祛风解痉，化痰散结。生地、三七味甘，功偏补养，且三七性温，可减雷公藤之苦寒，体现为性味相制，并通过扶正固本以制雷公藤之毒(肝毒性)；祛风除湿、活血通络之雷公藤与滋肾养肝之生地配伍，补泻兼施，则为异效相制；青风藤、僵蚕可增强雷公藤散邪之力，偏于增强药效；诸药配伍具有协同、互补的综合效应，以性味相制、异效相制、扶正相制的不同交互方式发挥“异类相制”配伍减毒作用。

研究运用药理毒理学、系统生物学与分子生物学多学科的技术和方法，从整体动物、组织器官、细胞与亚细胞、分子基因不同层次，阐释复方配伍协同减毒作用的微观机制；不同功效药物配伍通过细胞、分子调控网络的不同环节、不同靶点发挥的减毒效应也体现了“异类相制”的特征，为方药配伍理论源头创新及指导雷公藤的临床安全合理应用提供了科学依据。

4 结语

依据疾病的病机立法组方，合理配伍有毒中药，起到增效减毒的双重效应，与单纯的对应性配伍解毒药物有异。从辨证论治过程来看，临床在确定治法之后，依法遣药组方，通过不同功效药物的合理配伍，发挥其相辅相成、相反相制的综合作用，以符合辨证论治的要求。在中医药理论中，多从功能主治的角度论述复方配伍的合理性，而对有毒中药配伍减毒的组方理论阐述甚少。随着临床用药经验的积累，中药复方配伍的目的与形式已远远超出“七情”和“君、臣、佐、使”所论范畴。“异类相制”理论源于临床，为有毒中药的临床应用提供了新的理论指导，应深入阐明其科学内涵，探讨复方配伍减毒的机制，使中医药理论在传承的基础上发展创新，从而提高复杂难治性疾病的临床疗效及用药安全性。