巨噬细胞在慢性肾脏病中的作用

姜亚丽 刘晓渭

710032 西安，空军军医大学西京医院肾脏内科

一、巨噬细胞起源和异质性

1.巨噬细胞起源 巨噬细胞属于单核吞噬系统(mononuclear phagocyte system，MPS)，是由一群发挥关键性作用的异质性细胞组成[1]。在正常以及病变的肾脏组织稳态和免疫反应中发挥重要作用[2-3]。巨噬细胞是在集落刺激因子(colony-stimulating factor-1，CSF-1)的作用下起源于骨髓细胞中的祖细胞，并存在于所有组织中[4]。单核细胞的发育依次从成单核细胞到初始单核细胞再到终末单核细胞，进而从骨髓释放到血液中。在炎症状态下，单核细胞从血液迁移到受损组织或补充组织中的巨噬细胞。巨噬细胞是先天免疫的重要组成部分，其主要功能是清除外来病原体，还作为抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)和通过招募其他免疫细胞例如淋巴细胞产生适应性免疫应答[5]。基于其不同的功能及解剖位置将巨噬细胞分为不同亚群：库普弗细胞、朗格汉斯细胞和小胶质细胞，它们被定义为组织定居型吞噬细胞，在稳态、免疫应答以及组织损伤和修复中发挥关键作用[6]。在组织损伤的情况下，血液中的单核细胞被募集到损伤部位，然后根据所暴露的微环境信号进行分化[7]。因此，肾脏中巨噬细胞浸润是人类慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)的常见特征，且与肾损伤严重程度密切相关。

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CKD正在成为全球最重要的健康问题之一，极大的影响患者的生活质量。很多研究一致认为CKD所有病因中共同的致病途径均是瘢痕形成的进行性损伤[8]。CKD的病理特征是大量的细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)在肾小球和肾间质的沉积，通过肾小管上皮细胞、肌成纤维细胞和免疫细胞的相互作用及异常反应进一步加重，最终导致肾脏纤维化进展和肾单位丧失[9]。

2.巨噬细胞异质性 巨噬细胞根据其微环境的不同分为两种亚型：经典活化(M1)和选择性活化的(M2)巨噬细胞。虽然它们与组织损伤密切相关，但它们在宿主防御和组织修复中也起关键作用[10]。促炎M1型巨噬细胞在γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)或脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激下产生，通过释放某些细胞因子如IL-1，IL-6和肿瘤坏死因子(tumor neccosis factor-α，TNF-α)发挥促炎性作用。相反，M2型巨噬细胞通过精氨酸酶、甘露糖受体和IL-10等发挥抗炎功能[11]。另外，M2巨噬细胞可以进一步分为3个亚型：IL-4和(或)IL-13刺激下产生M2a，具有伤口愈合作用；M2b由免疫复合物诱导产生，在IL-10、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)或糖皮质激素作用下产生M2c，具有抗炎作用。因此，巨噬细胞具有高度的异质性，在不同的微环境刺激下表现出不同的表型和功能。尽管大量的体外研究支持这一分型，但这并不反映它们在体内的真实表型。

进一步研究显示，在糖尿病肾病晚期以M2型巨噬细胞浸润为主，导致肾小球硬化、肾小管间质性纤维化，最终肾功能衰竭。因此，不同巨噬细胞亚群可以共存于肾组织中，从肾损伤到恢复阶段，某些亚型可以在不同的疾病阶段占主导地位。Shen等[28]证明，M1巨噬细胞在吞噬去除坏死细胞可能仅在UUO早期，M2巨噬细胞似乎是晚期阶段的主要细胞类型。这些结果与Bhatina等[29]报道的结果一致，在CKD中由于持续性损伤和炎症的存在，M1巨噬细胞浸润明显多于M2型巨噬细胞。近期研究显示，巨噬细胞通过自噬作用抵抗肾纤维化进展。总之，在组织修复或纤维化过程中调节M2型巨噬细胞的功能机制在很大程度上仍然是不清楚的。

二、促炎性M1型巨噬细胞在CKD中作用

分泌抗炎性因子并促进伤口愈合和组织重塑的巨噬细胞被称为替代性活化的巨噬细胞(alternatively activated macrophage，AAM)[6]，即M2型巨噬细胞。已有研究证明组织定居型M1型巨噬细胞在炎症损伤修复过程中发生表型转化，进而赋予其保护和修复作用[19]。此外，巨噬细胞恢复阶段的消耗延迟，进一步表明巨噬细胞在肾脏修复中的作用。体外受IL-4和(或)IL-13调节的(M2a)巨噬细胞高表达甘露糖受体(CD206)和产生抗炎因子IL-10发挥免疫调节功能[20]。这些细胞分泌ECM，因此它们的主要功能与伤口愈合和组织重塑修复相关。已有研究证明，当细胞吞噬缺陷从而导致ECM清除不彻底时，肾损伤的功能性标记如血肌酐、血尿素氮和蛋白尿将会增加，引起炎症持续，从而导致M1：M2比例增加。另一类AAM是M2b型巨噬细胞，其负责与B细胞对话，除上调抗原呈递和促进Th2应答之外，也可诱导IL-10分泌[20]。因此，M2a和M2b型巨噬细胞均具有免疫调节作用。此外，M2c型巨噬细胞由IL-10、TGF-β和糖皮质激素诱导产生，这类细胞在体外产生抗炎因子和发挥抑制功能，通常称失活巨噬细胞。类似于经典M1型巨噬细胞，M2型巨噬细胞也参与调节先天和后天免疫。

1.M2型巨噬细胞在纤维化中起主要作用 通过巨噬细胞抗体或LC清除巨噬细胞可以减轻炎症和纤维化发展。然而，肾纤维化不仅可以由促炎性M1型巨噬细胞触发，也可以由M2型巨噬细胞和纤维细胞引起。持续的M2型巨噬细胞浸润可能导致伤口愈合、生长因子的不断产生，但伤口愈合的持续性可能是病理性的，导致不可逆的纤维化和进行性肾组织破坏。另外，M2型巨噬细胞可能通过内吞或产生促进血管生成因子来产生ECM，从而解决炎症[22]。例如，在IL-4和IL-13刺激下促进向M2表型转化，主要释放纤维连接蛋白1和其他可能直接影响肾纤维化的ECM分子[23]。同样，Kim等[24]最近证实，在体外顺铂刺激下，M2型巨噬细胞比M1型巨噬细胞在纤维化发展中起更重要的作用。需要注意的是，以上研究均在体外进行，体内关于巨噬细胞作为肾纤维化发展的重要因素之一仍在讨论中。

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另外，M1型巨噬细胞还通过调节Th1和Th17参与启动和维持炎症。在炎症小鼠中，Ly6Chigh单核细胞可分化为表达CC趋化因子受体2(recombinant chemokine c-c-motif receptor 2，CCR-2)的M1巨噬细胞，可见其配体CCL-2是单核细胞/巨噬细胞募集到损伤部位的重要趋化因子[16-17]。促炎巨噬细胞也释放基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPS)，使其能够迁移通过基底膜和间质ECM网络。LPS/IFN-γ激活的M1巨噬细胞通过分泌MMP-9诱导肾纤维化，其通过β-连环蛋白途径增加ECM转换[17]。也有研究显示，IRF5在M1型巨噬细胞极化中发挥重要作用。因此，抑制IRF5可阻止巨噬细胞诱导的炎症[18]。

巨噬细胞的致病作用已通过脂质体氯磷酸盐(liposome chlorophosphonate，LC)清除肾脏组织定居型的巨噬细胞得到证明[19]。然而，越来越多的证据表明，巨噬细胞在疾病进展期间也起修复作用。

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三、抗炎性M2型巨噬细胞在CKD中的作用

CKD的早期阶段触发了免疫细胞的浸润，首先是嗜中性粒细胞、自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)细胞和T辅助细胞(Th1/17)细胞，紧接着是M1型巨噬细胞[2]。在组织损伤处，间质微环境主要由病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)主导，如三磷酸腺苷、高迁移率组盒1(high mobility group box-1，HMGB-1)和尿酸以及来自坏死细胞释放的损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMP)。在毒性、感染或创伤性因素下，PAMP通过先天模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)激活定居型巨噬细胞和实质细胞，从而导致促炎细胞因子的分泌发挥防御作用，也是阻止病原体进一步侵入屏障[12]。在无菌肾损伤中，主要由DAMP驱动炎性巨噬细胞的浸润。

2.M2型巨噬细胞通过TGF-β促进纤维化 TGF-β超家族是来自巨噬细胞被研究最广泛的生长因子，其主要与M2型巨噬细胞、肾小管上皮细胞和肌成纤维细胞相关。肾脏中巨噬细胞产生的TGF-β可通过旁分泌激活肌成纤维细胞来促进纤维化。例如，Braga等[25]证明了M2型巨噬细胞以MyD88依赖性方式和TLR信号通路促进肾纤维化。López-Guis等[26]还证明，表达甘露糖受体-2的巨噬细胞可以减轻单侧输尿管结扎(unilateral ureteral obstruction，UUO)诱导的肾纤维化，而敲除甘露糖受体-2后纤维化加重。实际上，为了研究巨噬细胞特异性的TGF-β1在肾纤维化中的作用，Huen[27]利用TGF-β1转基因小鼠证明敲除该基因后肾脏损伤和纤维化并没有显著减轻。因此，他们提出特异性靶向骨髓TGF-β1可能不足以对抗肾纤维化的进展。靶向TGF-β1的几项研究突出了细胞因子在损伤及修复过程中的复杂作用，因此需要进一步的研究来证明。总而言之，肾纤维化不仅由促炎性M1巨噬细胞触发，M2巨噬细胞同样在肾纤维化和瘢痕形成中发挥重要作用。

四、持续的M2型巨噬细胞与纤维化有关

巨噬细胞通过Toll样受体(toll-like receptor，TLR)检测内源性危险信号，以髓样分化蛋白(MyD88)依赖方式诱导TNF转录，与IFN-γ联合激活巨噬细胞群体以及促进其分泌炎性细胞因子[13-14]。这两个信号的组合导致巨噬细胞具有更强的杀微生物以及增加促炎细胞因子、超氧化物和自由基产生的能力。也可通过上调主要组织相容性复合物Ⅱ类(major histocompatibility complexⅡ，mhcⅡ)结合共刺激分子(CD40、CD80和CD86)而促进细胞适应性免疫[15]。有学者支持肾损伤和炎症相互增强的理论，即自动扩增循环，称为坏死性炎症。坏死细胞释放DAMP，通过TLR激活单核细胞向M1型巨噬细胞分化。反过来，促炎细胞因子又刺激巨噬细胞分泌大量的坏死因子。因此，抑制促炎性巨噬细胞的活化将从免疫病理学阻止肾脏受损。

尽管普遍认为，在损伤恢复和组织重构中巨噬细胞主要参与凋亡和坏死细胞的清除[21]，但迄今为止，巨噬细胞的多种作用在体内研究中尚未得到认可。

3) 在预测之后使用误差预测对其进行修正，则可以控制绝对误差的范围，提高预测结果的稳定性，进一步改善预测精度。

五、以M2型巨噬细胞为基础治疗肾脏病

肾脏的再生能力有限。 因此，诸如基因和细胞疗法之类的干预措施正在被广泛研究，作为终末期肾功能衰竭的替代治疗方式[30]。然而，在CKD中诱导肾脏修复的方法很少。例如，Alagesar等[31]表明，肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)基因治疗能够增强糖尿病肾病中骨髓来源的细胞数量，且位于肾小球周围的主要是M2巨噬细胞。因此，研究CKD中巨噬细胞表型是有价值的。在许多CKD小鼠模型中，已经使用体外诱导的巨噬细胞用于细胞治疗，结果显示有抗炎或促炎作用。M2巨噬细胞如果要用作体内细胞治疗，必须至少满足两个条件：首先具备到达损伤组织或器官的能力，其次是稳定的表型[6，32]。这两个条件是特别重要的，因为输注的巨噬细胞如果从抗炎转向促炎表型对治疗是不利的。

1.不同来源M2型巨噬细胞回输后对肾脏作用不同 Wang等[22]的研究小组已经研究了在啮齿动物模型中输注体外培养的M2巨噬细胞对急性肾功能衰竭和CKD的影响。使用阿霉素肾病(adriamycin nephropathy，AN)的小鼠模型，证明与IL-4/IL-13诱导的巨噬细胞(M2a)相比，回输脾脏来源的M2c巨噬细胞可提供更多对肾脏结构和功能的保护作用，且这部分M2c表达高水平的B7-H4。因此，将M2c巨噬细胞的这种保护作用归因于B7-H4的表达。在AN联合严重免疫缺陷小鼠模型中，从脾脏分离的M2型巨噬细胞的输注与肾损伤的改善密切相关[22]。相比之下，有学者使用相同的小鼠模型，回输骨髓来源的M2型巨噬细胞并没起到保护肾脏作用，原因是该过程巨噬细胞发生了表型转化。因此，以上研究表明，回输骨髓M2型巨噬细胞由于发生表型转化而失去保护作用，而脾脏M2型巨噬细胞却不发生转变[33]。然而，骨髓是M2型巨噬细胞前体的适宜来源。因此，对于巨噬细胞的来源是另一个需要研究的关键问题。

2.M2型巨噬细胞通过产生生长因子促进肾脏再生 如今，巨噬细胞衍生的具有抗炎和再生作用的分子使用正在增加。例如，血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)是肾损伤时上调的具有保护和抗炎作用的酶，其下调与损伤易感性相关[34]。有学者在UUO小鼠模型中过表达HO-1阻止了多种与肾纤维化相关病理过程。另一方面，大量的证据表明TNF-α参与糖尿病肾病进展。此外，Awad等[35]证明阻断TNF-α可以通过减少巨噬细胞募集和细胞因子水平，从而赋予肾脏保护作用。因此，抑制TNF-α可能是治疗人类糖尿病肾病的可行策略。此外，Lin等[36]发现Wnt7b由巨噬细胞产生，通过作用于损伤的肾小管上皮细胞起到修复和再生作用，从而重建肾功能、减轻肾纤维化。

因此，巨噬细胞在肾脏修复、伤口愈合和再生过程中发挥很重要作用[2]。然而，巨噬细胞是否可以通过与其他细胞融合或转化为新的细胞来直接促进肾脏修复过程，或向其他类型细胞对话来间接促进肾脏修复过程，目前仍不清楚。

六、未来研究

研究证明，巨噬细胞具有组织修复作用。值得注意的是，由于巨噬细胞的异质性和可塑性以及不同微环境下互相转化特性，它们不会停留在某一特定的表型，许多表型可能共存于同一组织。巨噬细胞的功能在CKD的不同阶段尚未完全知晓，因此该领域需要更多的研究。已经证明，M2型巨噬细胞在肾脏损伤中有保护作用，但是否具有抗纤维化作用目前尚不清楚。在人类CKD中缺乏关于巨噬细胞类型、可塑性和功能的研究。因此，在测试人类基于巨噬细胞的治疗之前，需要进行更多的研究，因为巨噬细胞代表活化的表型谱，而不是稳定亚群。因此，需要开发在体内诱导真正的再生和修复巨噬细胞的更好的策略。