狼疮肾炎患者肠道菌群变化与临床病理特征、肾脏远期生存的相关性研究

黄佩琼 宋巧巧 舒泉

437100 咸宁，湖北科技学院内科教研室(黄佩琼，舒泉)；437100 咸宁市中心医院内科(宋巧巧)

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是累及全身多个脏器的自身免疫性疾病。狼疮肾炎(lupus nephritis，LN)是最常见的脏器受累表现，同时也是影响SLE预后、引起终末期肾脏病(end-stage renal disease，ESRD)的重要病因。根据Zhang等[1]和Maruyama等[2]的研究，Ⅰ型、Ⅱ型及Ⅴ型LN的肾脏预后较好，而Ⅲ型/Ⅲ+Ⅴ型/Ⅳ型/Ⅳ+Ⅴ型的病情较重、肾脏预后较差。因此，研究Ⅲ型/Ⅲ+Ⅴ型/Ⅳ型/Ⅳ+Ⅴ型LN患者肾脏预后的影响因素对评估病情、指导治疗均具有一定意义。

近些年，自身免疫性疾病、慢性肾脏病与肠道菌群紊乱的关系受到越来越多关注，国内李苗等[3]的研究表明，SLE患者存在肠道菌群紊乱且与多种免疫细胞因子的异常分泌有关；国内张育彬等[4]的研究表明，慢性肾脏病患者存在肠道菌群紊乱且与多种炎症细胞因子的异常分泌有关。但LN发病过程中肠道菌群的变化及其与肾脏预后的关系尚不明确。因此，本研究将以Ⅲ型/Ⅲ+Ⅴ型/Ⅳ型/Ⅳ+Ⅴ型LN患者为对象，分析肠道菌群变化与临床病理特征、肾脏远期生存的相关性，旨在阐明肠道菌群紊乱在LN发病中的作用并为今后治疗LN、改善LN预后提供新思路。

对象与方法

一、研究对象

选择2017年8月至2018年8月期间在我院诊断为LN的患者作为LN组。入组标准：(1)参照《中国狼疮肾炎诊断和治疗指南》，首次诊断为LN且病理分型为Ⅲ型、Ⅲ+Ⅴ型、Ⅳ型、Ⅳ+Ⅴ型[5]；(2)汉族；(3)随访时间≥1年；(4)临床病理资料完整。排除标准：(1)肾活检时已经达到ESRD的患者；(2)随访资料及临床病理资料不全。选择同期在我院诊断为SLE的患者作为SLE组，符合SLE诊断标准[6]且参照《中国狼疮肾炎诊断和治疗指南》[5]排除肾脏损伤、不符合LN的诊断；选择同期在我院体检的健康志愿者作为对照组。LN组共114例，包括男性23例、女性91例，年龄(42.5±10.8)岁；SLE组共80例，包括男性18例、女性62例，年龄(39.2±9.2)岁；对照组共100例，包括男性23例、女性77例，年龄(41.1±11.2)岁。3组间一般资料的比较差异无统计学意义(P>0.05)。

二、方法

1.肠道菌群的检测方法 收集LN组患者的粪便标本，采用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，采用荧光定量PCR试剂盒配置PCR反应体系，基因组DNA2 μL、反应混合液10 μL、5 μmol/L的上下游引物各0.5 μL、去离子水7 μL。所用引物分别为双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌标志基因的特异性引物。在荧光定量PCR仪上进行PCR反应，反应程序为95 ℃预变性3 min后95 ℃ 15 s、基因特异性退火温度(双歧杆菌52 ℃、乳酸杆菌54 ℃、大肠杆菌60 ℃)30 s、72 ℃ 45 s并重复40个循环。得到循环曲线后计算各样本中双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌的拷贝数。

2.远期肾脏生存的随访 采用门诊复查、电话或网络回访等方式进行随访，终点事件为ESRD，随访截止时间为确诊LN后1年。采用CKD-EPI公式计算肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)，eGFR<15 mL·min-1·(1.73 m2)-1且持续3个月以上定义为ESRD，未发生ESRD即为肾脏生存。

3.临床病理特征的收集 根据LN患者的病历资料收集以下临床病理特征：是否存在面部红斑、雷诺现象、光过敏、关节炎的症状，是否合并高血压，血红蛋白(hemoglobin，Hb)、白蛋白(albumin，Alb)、血肌酐(Scr)、24h尿蛋白含量，Hb男性<120 g/L、女性<110 g/L为Hb降低，Alb<35 g/L为Alb降低，Scr>106 μmol/L为Scr升高，24 h尿蛋白定量≥3.5 g为大量蛋白尿。病理分型参照ISN/RPS2003分型方案，包括Ⅲ型、Ⅲ+Ⅴ型、Ⅳ型、Ⅳ+Ⅴ型。

三、统计学方法

采用SPSS21.0软件录入数据，计量资料以Mean±SD表示、两组间进行t检验，多组间进行方差分析，两两比较采用LSD-t检验，影响因素的单因素及多因素分析均采用COX回归模型分析，预测价值采用ROC曲线分析，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、LN组、SLE组、对照组粪便中肠道菌群的比较

LN组、SLE组患者粪便中双歧杆菌、乳酸杆菌的含量明显低于对照组，大肠杆菌的含量明显高于对照组(P<0.05)；LN组患者粪便中双歧杆菌、乳酸杆菌的含量明显低于SLE组，大肠杆菌的含量明显高于SLE组(P<0.05)。(表1)

表1 LN组、SLE组、对照组粪便中肠道菌群的比较(lg copies/g)

二、不同临床病理特征LN患者粪便中肠道菌群的比较

不同性别、面部红斑、雷诺现象、光过敏、合并高血压、Hb、Alb等临床特征的LN患者，肠道菌群含量比较差异无统计学意义(P>0.05)；合并关节炎、SCr升高、大量蛋白尿、Ⅳ/Ⅳ+Ⅴ型患者粪便中双歧杆菌、乳酸杆菌的含量明显低于未合并关节炎、SCr正常、无大量蛋白尿、Ⅲ/Ⅲ+Ⅴ型患者，大肠杆菌的含量明显高于未合并关节炎、SCr正常、无大量蛋白尿、Ⅲ/Ⅲ+Ⅴ型患者，差异有统计学意义(P<0.05)。(表2)

三、LN患者远期肾脏生存影响因素的单因素COX分析

以LN患者是否发生ESRD为应变量，以肠道菌群及临床病理特征为自变量，在COX模型中进行单因素分析，性别、合并高血压、LN病程、SCr、大量蛋白尿、病理类型、双歧杆菌含量、乳酸杆菌含量、大肠杆菌含量是ESRD的影响因素(P<0.05)，Hb、Alb与ESRD的发生无明显关系(P>0.05)。(表3)

表2 不同临床病理特征LN患者粪便中肠道菌群的比较(lg copies/g)

表3 LN患者远期肾脏生存影响因素的单因素COX分析

四、LN患者远期肾脏生存影响因素的多因素COX分析

以LN患者是否发生ESRD为应变量，以单因素分析有统计学差异的因素性别、合并高血压、LN病程、SCr、大量蛋白尿、病理类型、双歧杆菌含量、乳酸杆菌含量、大肠杆菌含量为自变量，在COX模型中进行多因素分析，LN病程、SCr、病理类型、双歧杆菌含量是ESRD的影响因素(P<0.05)。(表4)

表4 LN患者远期肾脏生存影响因素的多因素COX分析

五、LN患者粪便中双歧杆菌含量预测远期肾脏生存的ROC曲线分析

绘制LN患者粪便中双歧杆菌含量预测远期肾脏生存的ROC曲线，曲线下面积为0.6641(95%CI：0.5367～0.7916，P=0.015)，根据约登指数最大值确定最佳截点为4.598，该最佳截点预测LN患者远期肾脏生存的灵敏度和特异性分别为67.03%和65.22%。(图1)

讨 论

LN是SLE最常见的并发症，也是造成ESRD常见的病因之一。根据ISN/RPS2003病理分型方案，LN共分为6个病理类型，其中Ⅰ型、Ⅱ型及Ⅴ型的预后较好，Ⅵ型已经发展为终末期肾病；而Ⅲ型、Ⅲ+Ⅴ型、Ⅳ型、Ⅳ+Ⅴ型的肾脏预后较差，同时也是目前临床上研究LN肾脏预后关注的重点。目前，研究LN患者肾脏预后的影响因素是肾脏病领域的研究热点，发现相关的影响因素不仅有助于指导诊疗方案的制定，也有助于阐明LN的发病机制并寻找新的治疗靶点。

肠道菌群的生理功能及在多种病理生理过程中的作用受到越来越多关注，多项研究证实在SLE、系统性硬化症、自身免疫性肝病、干燥综合征等自身免疫性疾病的发病过程中，均存在肠道菌群的紊乱[3，7-10]；相关动物实验证实，粪菌移植能够调节脓毒症大鼠、溃疡性结肠炎大鼠的肠道菌群并改善免疫应答、炎症反应[11-12]，提示肠道菌群紊乱参与免疫应答、炎症反应的调控并在自身免疫性疾病的发病中起重要作用。另有慢性肾脏病及急性肾损害的研究表明，肠道菌群的紊乱与肾功能损伤有关，调节免疫应答、炎症反应是可能的机制[13-14]。基于以上肠道菌群紊乱与SLE、肾功能损伤的研究结果，本研究分析了肠道菌群紊乱在LN发病中的作用，LN患者和SLE患者粪便中双歧杆菌、乳酸杆菌的含量明显减少，大肠杆菌的含量明显增加且LN患者肠道菌群的变化较SLE患者更为显著。上述SLE患者肠道菌群的变化结果与既往李苗等[3]的研究结果一致，LN患者肠道菌群的变化较SLE患者加重的结果表明肠道菌群紊乱可能参与了LN的发生。

LN的预后与病理分型有关，Ⅰ型、Ⅱ型及Ⅴ型LN的肾脏预后较好，而Ⅲ型/Ⅲ+Ⅴ型/Ⅳ型/Ⅳ+Ⅴ型LN的肾脏预后较差。国内杨静等[15]的研究发现，Ⅲ型与Ⅲ+Ⅴ型LN比较、Ⅳ型与Ⅳ+Ⅴ型LN比较，肾脏生存情况并无差异，提示在Ⅲ型或Ⅳ型LN的基础上发生膜性肾炎的病理改变不影响LN患者的肾脏预后。基于此，本研究未进行Ⅲ型与Ⅲ+Ⅴ型、Ⅳ型与Ⅳ+Ⅴ型的比较，而是按照病理特征分为Ⅲ/Ⅲ+Ⅴ型及Ⅳ/Ⅳ+Ⅴ型，通过分析不同病理特征LN患者肠道菌群的差异可知：合并关节炎、SCr升高、大量蛋白尿、Ⅳ/Ⅳ+Ⅴ型病理分型患者的肠道菌群紊乱更显著，表明LN患者肠道菌群的紊乱与部分临床病理特征的恶化有关，肠道菌群参与了LN病情的发生变化。

Ⅲ型/Ⅲ+Ⅴ型/Ⅳ型/Ⅳ+Ⅴ型LN的肾脏预后差、肾脏远期生存情况不理想，部分患者会迅速发展为ESRD。杨静等[15]的研究通过随访ESRD的发生情况来评价LN患者的肾脏预后，分析相关的影响因素发现：LN病程、平均动脉压、SCr、病理类型等临床病理因素均是LN患者肾脏预后的影响因素。本研究采用相同的方法随访了患者肾脏生存情况，将临床病理因素及肠道菌群共同纳入COX模型，分析远期肾脏生存的影响因素，临床病理特征与ESRD的关系与杨静的研究一致，即LN病程、SCr、病理类型是ESRD的影响因素，同时本研究还发现双歧杆菌含量也影响ESRD的发生，双歧杆菌含量降低是ESRD的危险因素。进一步通过ROC曲线验证了双歧杆菌含量与ESRD的关系可知：粪便中双歧杆菌含量的减少对LN患者发生ESRD具有预测价值。以上COX模型分析及ROC曲线分析结果均表明肠道菌群中的双歧杆菌在LN的病情发展变化中起关键作用，与ESRD的发生有关。

综上所述，LN患者存在肠道菌群紊乱且与部分临床病理特征相关，肠道菌群中双歧杆菌的减少与ESRD的发生有关、对ESRD具有预测价值，未来补充双歧杆菌可能成为延缓LN病情发展及ESRD发生的治疗手段。但本研究对肾脏生存的随访时间较短，后续应继续进行随访并收集资料，进而阐明肠道菌群紊乱在肾脏远期生存中所起的作用。