葛根素联用沙格列汀在高糖环境下对人脐静脉内皮细胞的影响

张一顺，李 曙，金 鑫

(1.马鞍山市人民医院 药剂科，安徽 马鞍山 243000；2.皖南医学院 a.临床医学院；b.药学院，安徽 芜湖 241002)

随着社会环境和人们饮食习惯的逐渐改变，心血管疾病及其并发症的发生率也越来越高。截至2018年，全国心血管疾病的患病率已达20.8%，在居民疾病死亡构成中占比达到40%以上，居于首位[1]。相关研究表明，血管内皮细胞结构损伤和功能异常是导致高血压、血栓、动脉粥样硬化等多种心血管疾病的病理基础[2-3]。在糖尿病心血管疾病发病中，高糖诱导的血管内皮细胞损伤是重要基础[4]。从葛根中提取的活性成分葛根素，属于异黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎等作用，在心血管系统疾病中具有重要作用[5]。沙格列汀是一种高效的二肽基肽酶-4(dipeptidyl pepti-dase 4，DPP-4)抑制剂，可通过选择性抑制DPP-4调节机体血糖的变化[6]，且对肾脏也具有保护作用。本研究探讨葛根素联合沙格列汀对高糖环境下人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)的损伤的影响，为临床上糖尿病的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 葛根素(方明药业)；沙格列汀(中美上海施贵宝)；DMEM低糖培养基，胎牛血清(Hyclone公司)；AnnexinⅤ-FITC细胞凋亡检测试剂盒(上海贝博)；β-actin 上游引物序列为5′-CAGAGCAAGAGAGGCATC-3′，下游引物序列为5′-CTGGGGTGTTGAAGGTCT-3′(216 bp)，P-选择素上游引物：5′-CCAGACAATGGACGGCAGCAG-3′，下游引物：5′-AGGGCITGGGTCAAACGCAGCA-3′(424bp)，NF-κB p65上游 5′-ATGTGCATCGGCAAGTGG-3′，下游 5′-CAGAAGTTGAGTTTCGGG TAG-3′(294 bp)(美国Santa Cruz)。

1.2 主要仪器 Beckman Coulter FC500 MCL流式细胞仪、离心机(安科)、水套式CO2培养箱(Thermo)、高速冷冻离心机(Thermo)、BIO-RAD梯度PCR仪。

1.3 方法

1.3.1 HUVECs的分离和培养 无菌环境下，取新生儿脐带组织，将脐静脉采用0.1%胶原酶消化、分离，细胞接种浓度为1×106，37℃、5%CO2培养箱内培养，0.125%胰酶-0.02%EDTA 溶液消化传代。3～6代的细胞用于实验。

1.3.2 实验设计与分组 将葛根素溶于0.02%二甲亚砜中配置成葛根素的药物母液，将沙格列汀溶于0.02%二甲亚砜中配置成沙格列汀的药物母液。使用高糖培养基(30 mmol/L)刺激HUVECs细胞24 h，不同梯度浓度葛根素(5、10、20、40、80 μmol/L)和沙格列汀(2.5、5、10、20、40 μmol/L)观察药物效应，MTT法检测，实验重复3次，选择用药浓度后随机分为5组：空白对照组、高糖组、高糖组+沙格列汀组、高糖组+葛根素组、高糖组+沙格列汀+葛根素组(联合用药组)，给药。处理时间为24 h。

1.3.3 观察指标

1.3.3.1 显微镜下观察各组细胞状态并拍照。

1.3.3.2 AnnexinⅤ-FITC/PI检测细胞凋亡 待细胞生长至对数期，消化离心，种于6孔板，药物处理后，将细胞用胰酶(0.25%不含EDTA)消化，收集悬浮细胞于10 mL离心管中，离心5 min，弃去培养液。用孵育缓冲液洗涤重悬1次，离心5 min，孵育缓冲液重悬，置于流式管中，加入FITC 5 μL避光孵育15 min，再加入PI避光孵育5 min，于1 h内上流式细胞仪检测。流式分析计算出不同分组凋亡细胞以及存活细胞百分比。

1.3.3.3 Q-PCR检测P-选择素和NF-κB p65 mRNA表达水平 提取HUVECs细胞总RNA，按逆转录试剂盒操作步骤进行RT反应。所得cDNA在实时荧光定量PCR仪(7300 Real Time PCR System，Applied Biosystem)上进行反应。用7300 System SDS Software分析数据，统计△△Ct值，计算RQ值以比较各组mRNA的表达。

2 结果

2.1 正常 HUVECs的培养 显微镜下可见正常 HUVECs单层贴壁生长，细胞呈短梭形或多角形，呈“铺路石”样(图1A)，与空白对照组相比，高糖组内皮细胞形态皱缩，细胞数目减少，细胞间缝隙变大，细胞形态不规则，细胞活力明显降低(图1B)，与高糖组相比，各给药组细胞形态改善，细胞数量增加，其中联合用药组最为明显(图1C、D、E)。

A.空白对照组;B.高糖组;C.沙格列汀用药组;D.葛根素用药组;E.联合用药组。

2.2 MTT检测 ①葛根素不同浓度组细胞增殖差异均有统计学意义；②其他各浓度组间细胞增殖差异均有统计学意义。根据浓度作用效果，结合相应参考文献[7-9]，本研究选用葛根素20 μmol/L与沙格列汀10 μmol/L分别作为单用药实验浓度，葛根素10 μmol/L+沙格列汀5 μmol/L作为联用药实验浓度。见表1。

2.3 流式细胞仪分析结果 与空白对照组(9.37±0.91)%比较，高糖可诱导内皮细胞明显凋亡，其凋亡率为(71.43±9.30)%，与高糖组比较，联合用药组可阻止高糖诱导内皮细胞凋亡，分别降至(52.17±9.31)%、(39.13±5.17)%。见图2、表2。

2.4 Real-time PCR检测结果 与空白对照组相比，高糖组内皮细胞P-选择素和NF-κB p65 mRNA表达升高(P<0.05)。与高糖组比较，联合用药组内皮细胞P-选择素和NF-κB p65mRNA表达水平降低(P<0.05)。见表3。

表1 不同药物浓度组MTT值的比较

A.空白对照组;B.高糖组;C.沙格列汀用药组;D.葛根素用药组;E.联合用药组。

表2 各组细胞凋亡率比较

表3 各组P-选择素和NF-κB mRNA的相对表达量

3 讨论

血管内皮细胞功能障碍、结构受损是多种心脑血管疾病重要始动环节之一。血管内皮是血管内膜的一道重要屏障，研究[9-10]发现患者内皮细胞损伤发生心血管疾病的概率明显高于无内皮功能受损患者。高血糖是导致血管内皮功能损伤的主要因素之一，随着机体血糖浓度的升高，血管舒张功能下降[11]，且血管内皮细胞受高糖诱导发生损伤时，也会引起内皮细胞的功能紊乱，这也是诱发糖尿病患者出现心脑血管并发症的重要因素，然而糖尿病中血管并发症又是主要致死致残原因[12]。因此研究具有重要意义，本实验以高糖环境下培养HUVECs建立细胞损伤模型，探讨葛根素联用沙格列汀对人脐静脉内皮细胞的保护作用及可能机制。

P-选择素在多种疾病(血栓形成、炎症反应等)的发生过程中都起到重要作用，其主要通过介导细胞与细胞或细胞与细胞基质间的黏附[13]，同时P-选择素在介导白细胞黏附以及血栓形成、肿瘤转移及细胞外信号传导等过程中均发挥重要作用[14]。当高糖活化细胞后，P-选择素迅速与胞膜融合，在细胞膜上进行表达。该实验中，高糖组P-选择素 mRNA表达上调，使用药物处理后，P-选择素 mRNA表达被逆转，表明葛根素与沙格列汀的联合使用可有效抑制白细胞与血管内皮细胞的黏附，进而抑制血小板的激活。因此，上述两种药物的联合使用可以抑制糖尿病心脑血管并发症的形成。

2004年Chandrasekar等[15]的研究阐述了细胞炎性反应的过程涉及了NF-κB信号通路的激活，并且影响了炎性以及代谢性疾病的发生。2011年Oeckinghaus等[16]研究证明NF-κB信号通路的激活可提高体内细胞因子的分泌进而诱发慢性炎症的过程，最终损伤细胞导致相应疾病。该研究中，高糖诱导的内皮细胞损伤，P-选择素和NF-κB mRNA的表达明显升高，而在联合用药处理后，P-选择素和NF-κB mRNA的表达水平也明显下调。提示高糖致血管内皮细胞损伤提高P-选择素的表达可能涉及NF-κB信号通路的参与，进而影响糖尿病心脑血管并发症形成。

综上所述，葛根素与沙格列汀的联合使用可有效抑制高糖条件下人脐静脉内皮细胞的凋亡，其机制可能是通过阻断NF-κB信号通路转导，降低P-选择素水平实现对VEC保护的生物学效应，这为进一步研究葛根素联合沙格列汀用于预防糖尿病心脑血管并发症展现出乐观的前景。