MicroRNAs与红系生长发育、增殖、分化及凋亡相关性研究进展

赵星云 卞茂红

miRNA是一种内源性长约21～26个碱基的非编码单链小分子RNA[1]。它在红细胞的生长发育、增殖、分化及凋亡的过程中参与调控。以下是对miRNA参与红系凋亡机制的介绍。

1 miRNA

1.1 miRNA的生成与作用：在细胞核内，编码miRNA的基因先转录成原始miRNA转录本，其在RNaseⅢ核酸酶Drosha的作用下，被剪切成约70 nt的发夹状前体miRNA(premiRNA)。pre-miRNA再从核内运输到胞质中，被核酸酶Dicer剪切成长约22个核苷酸的双螺旋miRNA。随后双螺旋解旋，互补链立即被降解，另一条链即为成熟的miRNA分子[2]。miRNA通过与靶基因的3'-末端非编码区不完全互补配对来完成对下游基因的调节。对于互补配对程度高的靶基因（如大多数植物中），miRNA对靶基因mRNA进行切割，而对于互补配对程度低的靶基因（如大多数动物中），miRNA则对靶基因mRNA进行翻译抑制[3]。

1.2 miRNA功能鉴定的方法与材料：对miRNA进行功能鉴定的方法，主要有微阵列芯片技术、实时PCR和RNA测序[4]，它们的完美结合可用于红细胞中miRNA在不同阶段的分析。另外，新一代测序（next generation sequencing，NGS）技术在miRNA功能鉴定方面的应用也得到了发展[5]。在这些技术中，往往需要首先调节miRNA在红细胞中的表达量或表达活性，才能进一步分析miRNA的功能，而这一过程即为功能获得与丧失试验的核心步骤。其中功能获得试验是将RNA低聚体注入斑马鱼的胚体中来促进内源性miRNA表达；而功能丧失试验则是通过向斑马鱼胚胎中注入吗啉代来抑制内源性miRNA表达[6]。相类似的还有：miRNA前体的异常表达、质粒或病毒载体编码的抑制剂以及模拟的或反义的寡核苷酸等，它们都可以用于功能获得与丧失试验，为分析miRNA功能提供有效信息[7]。

在鉴定过程中主要使用的实验材料有细胞株（CD34+造血干细胞、K562细胞和小鼠红白血病细胞等）[8-10]，工具酶（限制性内切酶、溶菌酶和Taq DNA聚合酶等），以及相关的细胞因子、引物等。

1.3 miRNA靶基因的预测：对miRNA靶基因进行预测可以在分子水平了解miRNA的作用。最常用的是生物信息学方法，预测软件包括Targetscan、Pictar、miRanda、miRDB等[11]。虽然预测miRNA靶基因的软件在不断升级，但仍有一定的局限性。

而实验分析方法则是通过比较某miRNA过表达的细胞与对照细胞中转录组与蛋白组水平来预测其靶基因的。其中，基因芯片分析法就是在转录组的水平上，通过瞬时转染或反义核酸等方法来调节miRNA活性，之后再利用基因芯片分析mRNA的变化进而找出相应miRNA的靶基因[12]。而SILAC技术（stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC）则通过查看转染miRNA后的蛋白表达水平变化来预测其靶基因[13,14]。

1.4 miRNA靶基因的验证：最直接的方法就是在转染或敲除miRNA后，利用荧光定量PCR或Western blot[15,16]，分别监测细胞中mRNA水平或蛋白水平的变化，从而确定miRNA与靶基因的对应关系。这些方法能够直接鉴定出miRNA的靶基因，准确度高，但无法鉴定出miRNA的靶位点。

目前最常用的方法是荧光素酶报告基因法[17,18]。该方法首先构建荧光素酶表达载体，将需要鉴定的miRNA靶基因3'UTR插入荧光素酶基因3'UTR中，然后将构建好的重组载体转染到细胞中，从而改变miRNA的表达水平，最后检测荧光素酶的表达情况，以分析3'UTR中是否含有miRNA的靶位点。

2 miRNA与红系的生长发育、增殖、分化及凋亡相关性

miRNA可以通过下调某些靶基因及蛋白的表达来调节红系的生长发育、增殖、分化及凋亡[19]。

2.1 miRNA与红系生长发育相关性

2.1.1 miR-144/451：miR-144和miR-451表达量在斑马鱼、小鼠及人类的红系生长发育过程中均有所增加[20-22]。当miR-451被敲除时，可延迟红系的生长发育及分化[23,24]。在斑马鱼体内，miR-144通过与Kruppel样因子结合来调节α血红蛋白的合成[25]，而miR-451则是通过与靶基因gata2结合来调节红细胞成熟[26]。当miR-144/451下调时，红系的生长发育将受到一定程度上的抑制。

2.1.2 miR-142：miR-142可以在一定程度上调节红细胞的形态、脆性及寿命，尤其是在调节红细胞骨架方面有着重要作用。缺乏miR-142的红细胞，其所含有的维持细胞结构的蛋白下调，在通过血管时，红细胞变形性下降，细胞结构不稳定，更易破碎。同时，miR-142还可用于抵抗氧化应激，尽管这一机制尚不明确。总的来说，当红细胞内缺乏miR-142时，该红细胞更易出现不规则的形态、异常的机械调节，也更易受到氧化应激对细胞本身的伤害[27]。

2.1.3 miR-191：在红细胞分化的终末阶段，很多miRNA下调，而miR-191异常增多，其在红细胞的增殖与分化过程中基本没有参与，但在脱核过程中起着重要的作用。研究表明，miR-191在小鼠红细胞中直接与Riok3及Mxi1等基因相关。当敲除Riok3与Mxi1时，miR-191上调，将阻止Gcn5的下调，从而阻止红细胞的脱核过程[28]。

2.2 miRNA与红系增殖、分化相关性

2.2.1 miR-223：在红细胞增殖和分化的过程中，miR-223表达下降将会导致晚幼红细胞的减少。LMO2是其靶基因，可编码一种蛋白，该蛋白是DNA结合转录多聚体复合物的一部分，用于调节红系分化相关的基因表达。当miR-223下调时，其对靶基因的抑制解除，通过编码相关蛋白，从而促进红系增殖、分化[29]。

2.2.2 miR-126/126*：miR-126及其互补序列miR-126*起源于EGFL7第七内含子，并特异性高表达于血管内皮细胞，可促进胚胎时期的血管新生及维持血管的完整性。在体内试验中，miR-126/126*在定向造血干细胞中的表达量较多，但随着细胞生长发育，其表达量逐渐减少。这提示miR-126/126*在红系生长发育及分化过程中，起到抑制作用。PTPN9蛋白作为miR-126/126*的靶基因，有着促进红细胞增殖及分化的作用。即PTPN9一定程度上可以解除miR-126/126*对红系分化的抑制[30]。

2.2.3 miR-200a：miR-200a的表达量在红系分化过程中逐渐减少，生物信息学及试验分析得知PDCD4和THRB都是miR-200a-3p的靶基因。对PDCD4和THRB进行功能获得与丧失试验显示这两个靶基因可促进红系基因的表达量。也就是说，miR-200a通过对PDCD4和THRB的调节来抑制红系分化[31]。

2.2.4 miR-320a：miR-320a通过与靶基因SMAR1结合来抑制红系分化。另外，SMAR1还可以通过与miR-221/222结合来调节红系分化，其中miR-221/222在早期红系分化中有重要作用[32]。因此，当miR-320a上调时，可以通过与靶基因SMAR1结合来抑制红系分化，也可以通过miR-221/222的路径来调节红系分化。

2.3 miRNA与红系凋亡相关性

2.3.1 miR-503：凋亡是细胞维持正常发育及内环境稳定的生理性死亡。miRNA的异常表达将引起异常的凋亡，最终导致贫血或癌症的发生。红细胞生命代谢过程中miR-503参与调控细胞周期阻滞和凋亡[33,34]。Roy等[35]对CD34+造血干细胞体外分化得到的CD235a+红细胞内miR-503进行检测，发现β-地中海贫血患者细胞内miR-503表达水平显著下调，且病情越重则miR-503表达水平越低。正常情况下miR-503能通过抑制细胞增殖基因CDC25A的表达使红细胞的细胞周期静止。由于地中海贫血患者红细胞分化过程中miR-503表达量很低，无法有效抑制CDC25A的功能进而导致无效红细胞的生成和过度增殖。

3 展望 尽管对红系生命代谢过程中所参与miRNAs的了解较过去有所增加，但对于它们的功能及其靶基因的探究仍是未来的巨大挑战，这将为研究红系分化提供新的思路。与此同时，通过完善红细胞生命代谢的调节机制，将为贫血等红系疾病提供新的治疗方案[36]。

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