血清可溶性α-Klotho在慢性肾脏病中生物学作用的研究进展

孙龙 朱国双 邓丹芳 林腊梅 李颖霞 王小琴

430065 武汉，湖北中医药大学(孙龙，朱国双，邓丹芳，林腊梅，李颖霞)；430061 武汉，湖北省中医院(王小琴)

1997年日本学者Kuro-o首次报道了抗衰老基因Klotho(KL)[1]，从此开启了KL研究的序幕。现已阐明膜型α-Klotho蛋白(membrane Klotho protein，mKL)在肾脏中有高水平的表达，其主要通过FGF23/FGFR/Klotho信号通路影响骨-肾-甲状旁腺内分泌轴的正负反馈机制，起到平衡体内的钙磷代谢的作用[2]。与mKL不同，可溶性α-Klotho(soluble α-klotho，sKL)被认为是一种类激素样物质，主要分布于血液、尿液和脑脊液中[3]。近期有关血清sKL的研究引起了广泛的关注，研究报道在慢性肾脏病(CKD)早期患者血清sKL的水平就出现下降，并随年龄的增长和估计肾小球滤过率(eGFR)的下降而逐渐降低[4-5]，患者血清低sKL水平还与其不良的肾脏疾病结局有关[6]。相关机制研究表明通过外源性补充或内源性上调血清sKL的水平，能调控多种信号通路发挥保护肾脏功能和延缓病情进展的作用。本文围绕sKL的结构和来源、生物学功能及与CKD并发症的关系等方面进行综述。

一、sKL的来源和结构

相关研究报道sKL主要有两种来源，一种是mKL蛋白胞外域的脱落，另一种是α-KL基因选择性剪切编码的分泌型KL蛋白[7-8]，其中mKL是一种Ⅰ型单次跨膜蛋白，主要表达于肾脏、甲状旁腺和脑脉络丛中[1]。由于其胞外域较长(包含两个重复序列KL1和KL2)，在去整合素-金属蛋白酶10(ADAM10)、ADAM17和β-淀粉样前体蛋白裂解酶1的作用下可脱落成为sKL[9]。根据酶裂解位点的不同生成3种产物，分别为单独的KL1或KL2(68 kDa)片段与保留胞外域完整性的KL1和KL2片段(130 kDa)[8]。然而，最新研究表明在人血清或脑脊液中尚不能鉴定到剪切后的分泌型KL蛋白，而且也无法检测到相对分子质量低于130 kDa的KL蛋白分子[10-12]，因此推测血清中的sKL可能主要来源于mKL的脱落。

研究发现sKL的生成和代谢均与肾脏密切相关。在肾脏特异性α-KL基因敲除的小鼠体内，其血清sKL的水平显著降低[13]，提示sKL主要由肾脏表达的mKL脱落产生[14]。在临床试验中，Khodeir等[15]发现CKD患者血清sKL水平随肾功能的损害加剧而进行性降低，并且血清中低sKL水平是CKD进展的独立危险因素[16]，与CKD患者较高的死亡风险和不良的肾脏病结局密切相关[6，17-18]。此外，血清sKL水平与肾脏组织病理学形态有较强相关性，血清高sKL水平能降低肾间质纤维化和局灶节段性硬化程度[19]。因此，血清sKL的水平可作为反映CKD严重程度的早期诊断和分期的标志物，并预测CKD患者的预后。

二、sKL的生物学功能

1.抑制TRPC6离子通道 瞬时受体电位阳离子通道6(transient receptor potential cation channel，subfamily C，member 6，TRPC6)是一种非选择性阳离子通道，在足细胞损伤中起着重要的致病作用[20-21]。Kim等[22]发现在体外培养的小鼠足细胞中，sKL通过减弱磷酸肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)依赖性TRPC6通道胞吐作用，能抑制足细胞中TRPC6介导的Ca2+内流，并改善TRPC6基因过表达小鼠的足细胞骨架重塑和白蛋白渗漏。

研究显示CKD晚期患者心肌肥厚的患病率高达90%，是导致舒张功能障碍、充血性心脏衰竭、心律失常和猝死的主要原因[23-24]，而且TRPC6通道介导的Ca2+内流在心脏肥大病理过程中起重要作用[25]。Xie等[26]发现在野生型小鼠和心脏特异性过表达TRPC6小鼠的离体心肌细胞中，sKL能减弱TRPC6通路胞吐作用以抑制该通道的活性。进一步研究发现在5/6肾切除术诱导CKD模型小鼠中，表现出严重的心脏肥大和心脏纤维化。通过向KL杂合子CKD小鼠注射sKL能抑制心脏中TRPC6通道介导的Ca2+信号传导，保护心脏免受应激诱导的心脏肥大和心脏纤维化[27]。

2.抑制Wnt/β-catenin通路 Wnt蛋白是一种高度保守的细胞外信号分子家族[28]，在CKD患者中Wnt信号通路出现异常激活并诱导下游β-catenin蛋白去磷酸化，进而上调多种纤维化因子的表达[29]。Zhou等用KL载体转染人近端肾小管上皮细胞HKC-8细胞，发现KL的异位表达抑制了Wnt1介导的β-catenin激活及其核转移。体内实验发现在单侧输尿管结扎(UUO)诱导的肾纤维化模型中，通过静脉注射编码sKL的质粒上调小鼠体内sKL的表达，能抑制UUO小鼠梗阻侧肾脏中的β-catenin和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达，并减少梗阻侧肾脏中肾间质基质蛋白的表达和沉积，从而减轻肾间质纤维化[30]。

近期研究发现sKL还可以通过抑制Wnt/β-catenin通路介导的氧化应激以改善足细胞功能障碍[31]。Zhou等发现在高级氧化蛋白产物(advanced oxidation protein products，AOPPs)诱导的蛋白尿小鼠足细胞中检测到Wnt/β-catenin通路的激活。研究通过上调模型小鼠肾小球中sKL的表达，能抑制β-catenin的活化并下调相关纤维化因子的表达，由此可保护足细胞的超微结构、发挥改善蛋白尿作用。

3.抑制TGF-β1信号传导 转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是一种强效的促纤维化细胞因子[32]，其诱导的上皮间质转分化(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)在组织纤维化中发挥关键的作用[33]。研究发现向UUO小鼠体内注射纯化的重组sKL蛋白能抑制梗阻侧肾脏的纤维化。虽然检测显示sKL并未抑制UUO肾脏中TGF-β1的表达，但sKL能直接结合II型TGF-β受体以抑制TGF-β1信号传导并下调下游相关纤维化因子的表达[34]。

研究还报道了sKL能抑制主动脉瓣的纤维化。研究发现在衰老加速小鼠P1(senescence-accelerated mice P1，SAMP1)的主动脉瓣中发现TGF-β1、α-SMA(肌成纤维细胞标记物)和Scleraxis(胶原合成的转录因子)的表达上调，表明加速衰老与肌成纤维细胞转变和胶原基因激活有关。同时研究发现在该小鼠体内血清sKL水平急剧下降，通过向小鼠体内注射sKL cDNA的腺相关病毒增加其血清sKL的含量，能抑制主动脉瓣中的TGF-β1和Scleraxis的上调并且减弱SAMP1小鼠中的主动脉瓣纤维化疾病[35]。

4.激活Nrf2/HO-1通路 核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2‐related factor 2，Nrf2)是一种氧化还原敏感的转录因子，其介导内源性抗氧化剂保护，并抵抗与心血管疾病相关的氧化应激[36]，而且CKD导致的血管老化主要与Nrf2介导的抗氧化防御减弱相关[37]。研究报道在人主动脉平滑肌细胞(HASMC)中，重组sKL能上调Nrf2以及下游血红素加氧酶(HO-1)和过氧化物酶-1(peroxiredoxin-1，Prx-1)的表达，并增加HASMC中还原型谷胱甘肽(细胞内抗氧化剂)的含量，而且经过sKL预处理的HASMC能显著减少血管紧张素II(AngII)诱导的超氧化物产生，减弱AngII诱导的细胞凋亡，表明sKL通过激活Nrf2信号传导发挥抑制AngII介导的细胞凋亡的作用[38]。

Cui等[39]的研究进一步证实了sKL对Nrf2的调控作用 。该研究显示在过氧化氢(H2O2)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)氧化损伤模型中，sKL通过激活PI3K/AKT途径上调Nrf2/HO-1的表达，能清除活性氧含量，增强抗氧化酶(超氧化物歧化酶和HO-1)的活性，抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)的分泌，从而显着增强HUVEC的活性。

5.激活TRPV5离子通道 Ca2+的肾脏排泄对全身钙稳态至关重要并且受到严格调节，大约95%～98%滤过的Ca2+沿着肾小管被重吸收[40]。瞬时受体阳离子通道亚家族V成员5(transient receptor potential cation channel，subfamily V，member 5，TRPV5)是在远曲肾小管和集合管的顶膜中表达的选择性Ca2+通道，主要介导Ca2+的跨细胞再吸收[41]。Wolf等[42]报道在内源性FGFR缺乏的细胞系中，用纯化的sKL能激活该细胞中的TRPV5通道，表明sKL具有不依赖FGF23的Ca2+调节作用，而且mKL-FGFR协同受体的激活抑制了1，25-二羟维生素D3的合成，并减少肠道对磷酸盐和钙的吸收[2]。因此，推测sKL激活TRPV5离子通道可能会抵消1，25-二羟维生素D3合成对钙平衡的影响，使FGF23-Klotho-FGFR轴能够独立于钙平衡调节体内磷酸盐平衡。

6.抑制FGFR1/ERK通路 研究发现sKL通过抑制FGFR1/ERK通路抑制血管钙化。Zhang等[43]在人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)中发现，当hBMSCs与sKL孵育后能下调FGFR1和pERK1/2的表达，并减少成骨细胞特异性基因表达和矿物质沉积，发挥减弱其成骨分化的作用。Hum等[44]的研究进一步证实了这一机制，在内皮型一氧化氮合酶(eNOS)敲除的db/db(db/db-eNOS-/-小鼠模型中，随着瘦素受体活性的丧失和eNOS的破坏，该模型小鼠表现出血糖显著的升高和进行性肾损伤。在db/db-eNOS-/-小鼠中，通过注射重组sKL能减轻模型小鼠的高磷血症和血管钙化。体外实验显示其减轻血管钙化的作用与sKL下调FGFR1/ERK通路相关。

7.sKL与CKD相关并发症的关系 血清sKL水平与CKD心血管并发症之间存在较强相关性。在一项针对维持性血液透析(maintenance hemodialysis，MHD)患者的多中心前瞻性研究中发现，血清中低sKL水平与心房纤颤(AF)发作相关，而且sKL与AF的关联性强于传统的心血管危险因素(如肾衰竭、年龄、性别、动脉硬化和心脏瓣膜病等)[45]。另外，在非透析患者的外周血中，低sKL和高FGF23水平也与AF的发作显著相关[46]。

sKL还与CKD患者心肌肥厚和血管的功能相关。Kim等[47]发现血清sKL水平与左心室质量指数(LVMI)呈显著负相关，但与臂-踝脉搏波速度(baPWV)之间没有显著关联，说明血清sKL是LVMI的独立生物标志物，但与动脉僵硬度无关。

研究还发现，sKL与CKD骨代谢异常的相关性。Zheng等[48]报道MHD患者血清sKL水平与骨密度(BMD)的变化具有相关性。Spearman相关分析结果显示，MHD患者股骨颈和腰椎的BMD都与sKL水平呈正相关，说明血清sKL水平的增加可降低终末期肾病患者的CKD-MBD和低骨密度风险。此外，血清sKL浓度降低还是MHD患者脑血管疾病(中风和无症状脑梗塞)的独立危险因素[49]。

三、小结和展望

上述研究阐明，血清中sKL主要由肾脏产生、代谢和清除，其介导多种信号通路以改善足细胞结构、降蛋白尿、调节氧化应激和炎症反应、抑制纤维化、调节钙磷代谢、抑制成骨分化和保护血管功能。研究发现血清中sKL具有作为CKD生物学标志物的潜力，通过检测血清sKL的水平能对患者病情进行早期诊断并判断远期预后，有助于临床的诊断和疗效的评价。然而研究显示，商用sKL抗体质量的标准化和一致性结果不佳[50]，可能会导致检测结果存在较大的偏差甚至影响最后的研究结论，这提示使用相关试剂检测前需衡量其质量和检测的一致性，尽量减少测量所导致的偏差。

综上所述，sKL在保护CKD患者肾功能、延缓病情进展以及作为生物学标志物方面发挥重要的作用，而且其作为CKD治疗靶点具有较好的潜力。