多发性骨髓瘤患者外周血淋巴细胞亚群的检测及临床意义

丁侣霞，赵 枰，陈 相*

(1 江苏省如东县中医院检验科，如东 226400；2 江苏省南通市第一人民医院检验科)

多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是起源于浆细胞的血液系统恶性肿瘤，浆细胞的异常增殖可导致机体免疫功能异常，机体抗肿瘤的免疫反应以细胞免疫为主，而淋巴细胞亚群是机体调节免疫应答水平、维持免疫稳定的重要细胞，其表型和功能上面的异常可进一步导致细胞免疫监视功能的缺陷，对恶变浆细胞的清除能力亦下降，因此，该疾病的产生及病情发展与机体免疫细胞数量及功能的异常有着紧密的联系[1-2]。本研究应用流式细胞术对MM患者淋巴细胞亚群进行检测，进一步了解淋巴细胞亚群的变化，以期通过调节患者机体的细胞免疫功能来延长生存期并最终清除肿瘤负荷提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取南通市第一人民医院2015年1月—2018年12月收治的MM患者39例(MM组)，男15例，女24例，年龄48～81岁，中位年龄64岁，均符合MM诊断标准；另选取24例同期体检健康者(对照组)，男10例，女14例，年龄45～78岁，中位年龄60岁。两组在性别、年龄上差异均无统计学意义(均P＞0.05)，具有可比性。研究对象在采血前均签署知情同意书，并排除其他肿瘤、急慢性感染及自身免疫性疾病。

1.2 主要仪器和试剂 BD FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)，荧光单克隆抗体试剂盒CD3-FITC/CD16+CD56-PE/CD45-PerCP/CD19-APC、CD-3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC(中国北京同生时代生物技术有限公司)。

1.3 检测方法 抽取空腹外周静脉血2 mL，用EDTA-K2抗凝。采用免疫荧光法：先取两支FACS专用试管，在流式管底部分别加入20 μL CD3-FITC/CD16+CD56-PE/CD45-PerCP/CD19-APC和CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC试剂，采用反向移液技术在各流式管中加入50 μL抗凝全血，涡动混匀3 s，室温避光放置20 min，加1 mL溶血素，涡动混匀10 s，再避光静置10 min，500 g离心5 min，弃去上清液，加细胞染色缓冲液4 mL洗涤，500 g离心5 min，弃去上清液，重复洗涤1次，加细胞染色缓冲液200 μL，混匀，上机，用流式细胞仪检测。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理，用Kolmogorov-Smirnov Z检验进行正态性检验，以表示，两组间比较采用两独立样本的t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

两组患者外周血CD3、CD4细胞比例差异无统计学意义(P＞0.05)；MM组患者CD8、CD16+56细胞比例较对照组高，CD19细胞、CD4/CD8比值较对照组下降，见表1。

表1 两组患者淋巴细胞亚群水平比较(,%)

3 讨论

MM是源于浆细胞的恶性疾病，在某种程度上，本身具有免疫抑制效应和阻碍肿瘤细胞凋亡，有利于骨髓瘤细胞的存活。淋巴细胞是机体免疫系统的主要细胞，机体在抗肿瘤过程中T淋巴细胞和自然杀伤(natural killer,NK)细胞有着重要的意义。T淋巴细胞具有杀伤靶细胞、免疫监视、免疫调节等功能，其中，CD4+T细胞有辅助和诱导作用，并促进CD8+T细胞吞噬活性，以提高抗肿瘤能力；CD8+T细胞可产生细胞毒作用，对肿瘤细胞进行清除，并协调CD4+T细胞。CD4/CD8比值在一定程度上反映机体的免疫功能状态，比值相对正常抗肿瘤效应最大，平衡一旦被打破，机体的抗肿瘤免疫会显著降低，且利于肿瘤的生长、复发和转移[3]。NK细胞被视为肿瘤免疫第一道防线的“效应器”，杀伤力强，不受主要组织相容性复合体限制，不依赖于补体和抗体，也不需要外来抗原激活，直接杀伤肿瘤细胞。当机体发生肿瘤时，肿瘤细胞本身可对NK细胞产生多种抑制作用。B淋巴细胞可产生抗体，抗原提呈及分泌细胞因子参与免疫调节等，发挥体液免疫的功能。根据淋巴细胞表面CD分子可分为：CD3+T细胞、CD19+B细胞、CD16+56+NK细胞等。CD3+T细胞又分为CD3+CD4+T细胞即CD4+辅助/诱导T细胞(Th细胞)和CD3+CD8+T细胞即CD8+抑制/杀伤T细胞(Ts细胞)，细胞亚群间相互协作、制约、平衡，维持内环境的稳定，比例失衡时，机体的免疫力降低，对肿瘤发生的控制力亦会降低[4-5]。近年来嵌合抗原受体正在进行临床试验，初步结果令人鼓舞，T细胞治疗的新靶点正在研究中。然而，由于固有免疫抑制网络对细胞疗法产生耐药性仍是实现治愈MM的主要障碍。以过继转移T细胞为基础同时深入研究嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)靶向MM。目前针对B细胞成熟抗原的CAR-T细胞研究已有初步进展，但最终对CAR-T细胞疗法的耐药性仍存在问题。通过对MM患者外周血T细胞亚型改变的研究，可为其治疗提供实验基础。

本研究结果显示，MM患者CD8+T细胞较对照组明显增高，表明机体的免疫功能受抑，机体原有的免疫调节能力降低，机体抗肿瘤的功能亦降低，促进病情进展、加重[6]。CD8+T与CD4+T细胞在机体内构成了一种免疫平衡，维持正常的免疫功能，异常增高的CD8+T细胞使CD4+/CD8+的比例降低，平衡被打乱，这对MM患者进行CD8+T细胞治疗以重建免疫平衡可能会成为一个新的思路。CD16+56+NK细胞的细胞毒性作用通过某种机制重整MM患者体内的骨髓瘤细胞，其功能下降可能与疾病的进展相关，在控制疾病方面具重要的意义，但这种机制尚不明确。MM患者NK细胞较对照组明显降低，说明机体抗肿瘤的能力已经被削弱，提示患者可能预后不良，对临床评估预后有重要的价值。NK细胞的降低也可能与患者所处疾病时期有关。CD19是一种表达在前体细胞和成熟B细胞细胞膜上的表面抗原。它还表达于各种B细胞恶性肿瘤，包括B-急性淋巴母细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤。针对CD19的CAR-T细胞疗法是迄今为止应用最广泛、最成功的嵌合抗原受体。并且自体CD19 CAR-T细胞已被用于表达CD19的B细胞恶性肿瘤，并取得了巨大的成功[7]。本研究结果显示MM患者CD19+B细胞较对照组明显降低，提示患者体液免疫功能亦存在缺陷，可能的原因[8]：(1)MM常伴有异常单克隆免疫球蛋白增多，其Fc段可与正常B细胞表面Fc受体结合，阻止信号通路的刺激，反馈抑制正常B细胞分化成熟；(2)MM患者白细胞介素(interleukin,IL)-6大量分泌，引起肝细胞产生的C反应蛋白增多，进而抑制T辅助细胞的功能，IL-4产生受抑，干扰多克隆B细胞的激活；(3)骨髓瘤细胞诱导正常前B细胞凋亡，干扰正常多克隆B细胞的分化成熟。MM患者外周血多克隆B细胞的减少，导致体液免疫功能缺陷[9]。由于样本量的问题可能使健康人群和MM患者的差异参数略微接近，在未来的研究中将进一步扩大样本量，同时进一步研究MM患者体内T细胞亚群改变的潜在机制。

综上所述，本研究应用流式细胞术检测MM患者外周血淋巴细胞亚群的水平，了解患者机体的免疫状态，通过T细胞来观察细胞免疫功能、B细胞来观察体液免疫功能、NK细胞来反映机体抗肿瘤的能力，便于及时了解患者的病情变化，为MM患者免疫治疗策略提供指导,为患者制定适合有效的诊治方案及判断预后提供依据。