杂交构树叶片愈伤组织诱导的研究

颜慧萍， 高正龙， 陈谭星， 曹力凡， 王品胜

（河南省高新技术实业有限公司，郑州 450000）

构树（Broussonetia papyrifera）属于荨麻目［1］桑科构树属植物，常见于多年生落叶乔木或灌木［2-3］. 全世界范围内查明该属有5种，主要分布于亚洲东部的及太平洋岛屿温带和热带地区，目前我国发现有4种，即构树、小构树、藤构和落叶花桑［4］. 构树对不同环境适应能力好，是一种速生乔木，10～20年即可成材［5-6］. 杂交构树叶片表面平滑，与传统意义上的老构树有所不同，以其枝干、叶片、树汁为原料用来制成茶叶、药品、服装以及营养品和护肤品等，构树食品还被发现有奇特的功效［7］. 种植杂交构树投资相对较少，企业大多可在短期内收获较高效益，因此具有良好的市场需求. 构树种子苗量化生产是其产业化发展的目标，构树的繁殖方法主要有种子繁殖、扦插繁殖和快速繁殖［8］. 构树树叶富含大量粗蛋白和类黄酮素，是优质植物蛋白饲料，可用于各种动物的养殖，以构树制饲料是未来饲料市场发展的一大趋势，其综合营养成分超过豆类植物，还可代替发酵大豆粕、鱼粉等动植物蛋白质，因此构树被专家称为神奇的养殖之星［9］.

为了能保持杂交构树的优良性状，同时满足大量繁殖的种苗要求，因此需要大力寻找一种低成本并且高效快速的繁殖方式. 目前我国杂交构树繁殖技术依然比较落后，以扦插为主，这些方法限制了杂交构树繁殖的速度，不能满足市场需求. 杂交构树组培快繁技术是最简单、便捷、快速的方法，能有效缩短杂交构树的生长发育周期. 万文等［10］研究了杂交构树茎段组培快速繁殖体系，但目前以茎段组培繁殖的系数不高，魏会琴等［11］侧重研究构树叶片组培体系激素配比，本文从构树叶片组培光照条件、消毒方式及不同激素配比的培养基方面入手，筛选出杂交构树叶片愈伤诱导的最佳条件，以期为杂交构树快繁体系的建立及良种性状的保存和遗传转化提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料

2019年10月中下旬，在河南省兰考构树基地采集10～15 cm带有腋芽的1年生杂交构树（科构101）枝条，用湿毛巾包裹带回实验室，保存在4 ℃冰箱内，每日早晚喷水2次，以保持枝条湿润. 低温处理3 d后把修剪枝条成8 cm长左右的树枝，插入瓶中水培，放置在25 ℃、12 h/d光照条件下催芽，2 d换水1次，约15 d后枝条开始长叶.

1.2 仪器及耗材

仪器：超净台（YJ-VS-2型双人垂直超净工作台）、电磁炉、玻璃棒、镊子、手术刀.

耗材：MS培养基（合肥巴斯夫生物科技有限公司）、琼脂（天津市科密欧化学试剂有限公司）、蔗糖（天津市科密欧化学试剂有限公司）、盐酸、75%乙醇、去离子水、6-BA和NAA（合肥巴斯夫生物科技有限公司）. 植物激素6-BA和NAA分别用0.1 mol/L NaOH溶解后配制成0.1 g/L母液备用.

1.3 培养条件

培养温度（25±2）℃；相对湿度约50%；暗培养.

1.4 数据分析

采用Microsoft Excel 2013整理数据.

愈伤组织诱导率=（诱导出愈伤组织的外植体数/接种的外植体数）×100%.

褐化率=（褐化数/接种的外植体数）×100%.

2 结果与分析

2.1 不同消毒方式对杂交构树叶片愈伤诱导的影响

待新生枝条长至1 cm 左右时，取叶片（保留叶柄）在加洗涤剂的无菌水中浸泡约20 min，用软毛刷轻轻刷洗叶片表面，将刷洗后的叶片放在塑料量杯内，纱布封杯口在流水下冲洗40 min 后，浸泡在蒸馏水中备用.

将处理好的构树叶片转入超净工作台内进行外植体的表面灭菌和接种.

1）灭菌. 采用4 种不同类型组合的消毒处理方法：①70%酒精浸泡20 s，无菌水冲洗5～6 次，0.5%次氯酸钠（加吐温80）消毒15 min，无菌水冲洗5～6次［12］. ②70%酒精浸泡20 s，无菌水冲洗3次，0.1%升汞（加吐温80）消毒8 min，无菌水冲洗5～6 次. ③70%酒精中浸泡20 s，无菌水冲洗3 次，用0.1%升汞（加吐温80）消毒3 min，无菌水冲洗3次，再用0.5%次氯酸钠消毒5 min，无菌水冲洗5～6次. ④70%酒精蘸洗1次，无菌水冲洗3 次，0.5%次氯酸钠（加吐温80）消毒5 min，无菌水冲洗3 次，0.1%升汞（加吐温80）消毒4 min，无菌水冲洗6次.

2）接种. 将叶片切成7 mm×7 mm的方块，再每个叶片上用手术刀片划1～2条划痕，直接接种于MS基础培养基上. 每个消毒处理设置15个重复，每个重复4片叶子，分别装入瓶内，放置黑暗处30 d，统计污染率和褐化率.

从实验结果看出（表1）：第1种消毒方式污染率较低，褐化较严重；第2种消毒方式污染率最高，褐化情况最严重，且叶片大多失去活性；第3 种和第4 种消毒方式未发现污染，相比之下，第4 种处理褐化率最低.由此看出，消毒时间的长短对杂交构树愈伤诱导及叶片成活有重要影响，如果消毒剂使用单一，会造成污染率高，时间太短会造成叶片消毒不彻底，而消毒时间太长，酒精和升汞会对叶片细胞造成不同程度的损伤.综合比较，第4种方案的消毒时间和消毒方式最佳.

表1 不同消毒方式结果统计Tab.1 Results statistics of different disinfection methods

2.2 不同光照时长对杂交构树叶片愈伤诱导的影响

为研究光照时间对构树叶片愈伤诱导的影响，将无菌苗（兰考中科华构培育）叶片切成5 mm×5 mm接种到表2中的6种培养基上. 每个培养基均使用MS基础培养基添加不同激素配比，分别设置12 h/d、16 h/d光照时间和全黑暗处理，30 d后统计结果.

表2 杂交构树叶片愈伤组织诱导的不同光照条件设计Tab.2 Design of different light conditions for callus induction of hybrid Broussonetia papyrifera leaves

观察实验结果发现，光照12 h/d处理中的叶片培养到第3天有的就开始发褐，到第10天已经有3/5 的叶片边缘出现浅褐色，部分叶片周围的培养基变也为褐色. 光照16 h/d处理的叶片第7天时有4/5的叶片边缘发生黑褐色且叶片卷缩成团. 第30天光照12 h/d处理和16 h/d处理的叶片已全部褐化，叶片卷缩失去活性，周围培养基也呈浅褐色. 黑暗处理的叶片在第30后，4、5、6处理的叶片愈伤大多长出，呈白色疏松质地.

2.3 不同植物生长调节剂对杂交构树叶片愈伤诱导的影响

选择MS作为基础培养基，添加不同质量配比的6-BA和NAA、蔗糖30 g/L、琼脂7 g/L，调节pH至5.8，制成杂交构树叶片愈伤诱导培养基（表3），培养温度（25±2）℃，黑暗处理30 d，叶片大小约7 mm×7 mm，每片叶片均经划痕处理. 在无菌条件下，每组接10瓶，每瓶4片叶子，连续培养30 d. 接种30 d后观察不同激素配比的培养基对杂交构树愈伤组织的影响，统计愈伤诱导情况，并设定愈伤组织诱导率、褐化率、愈伤生长状态这3个参数用于评估试验效果.

观察实验结果发现：培养至第7天，接至愈伤组织诱导培养基上叶柄的划痕部位首先开始出现淡绿色颗粒状愈伤组织，之后带有划痕的叶片开始出现浅黄色愈伤颗粒；第15天左右，叶片周围开始密集出现大量黄绿色或半透明色的愈伤组织颗粒. 处理5、12、14、16的愈伤诱导率均可达到100%，按照愈伤褐化情况比较，处理16 褐化率过高；按照愈伤生长状态比较，处理5 和14 愈伤生长状态不佳，仅处理12 愈伤状态达到“最好”（表4）. 由此可得：MS+6-BA2.5 mg/L+NAA0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L的激素配比最适合杂交构树叶片愈伤诱导.

表3 杂交构树叶片愈伤组织诱导的培养基Tab.3 Different media for callus induction of hybrid Broussonetia papyrifera leaves

表4 不同浓度激素组合对杂交构树愈伤组织诱导的影响Tab.4 Effects of hormone combinations on callus induction of hybrid Broussonetia papyrifera leaves

3 讨论与结论

在进行植物组织培养过程中，器械、植物组织、培养基操作环境等消毒是否彻底都关系到实验的成功与否. 其中最不可控的是植物组织，具体的消毒方式需要根据植物类型设计具体的消毒方式. 因此，如何减少污染、最大程度提高成活率、减少实验误差是组培过程中的难点与重点.

从以上实验的结果也可以看出，影响杂交构树愈伤组织诱导的一个重要因素是消毒方式. 从野外带回来的杂交构树茎段附着大量的细菌，实验中既需要去除植物上的细菌，又不能伤害到叶片，还要保证植物叶片表皮细胞健康有活性，就需要选择合适的消毒剂. 经前人学者的大量研究［13-14］，升汞和次氯酸钠是组织培养中经常使用的消毒剂，杀菌效果较好. 本实验褐化率随消毒时间增加与张付远等［15］的实验结论一致，因此组织培养实验中愈伤诱导的难点重点是掌握好消毒剂的类型、浓度以及消毒的时间.

光照时间对杂交构树愈伤组织的诱导至关重要. 经实验，杂交构树叶片在黑暗处理下产生愈伤的能力大于光照处理下愈伤产生的能力. 有研究认为，光照处理下矮凤梨愈伤组织的增殖率显著高于其在黑暗处理下的增殖率［16］，这与本试验研究结果相反；而在暗培养条件下，南方红豆杉可获得大量愈伤组织［17］，杉木在暗培养和低强度光照条件下愈伤组织生长状况均良好［18］，这些结论与本试验结果相一致. 可见不同类型的植物愈伤组织对光照条件的选择和适应性存在明显的物种差异. 植物对光照条件的反应及要求存在复杂性和多变性，具体的影响机理有待进一步学习研究，本试验仅给未来杂交构树叶片愈伤组织的诱导提供一定参考.

在植物细胞培养过程中，植物细胞生长素和植物细胞分裂素之间的配比，直接影响到植物愈伤生长状态. 本试验以MS为基本培养基，通过调节其与6-BA和NAA的配比诱导杂交构树叶片愈伤生长，高浓度的6-BA有利于诱导杂交构树叶片愈伤，这与前人研究发现6-BA和NAA可有效诱导愈伤增殖［19-20］且6-BA在愈伤组织诱导中起关键作用结论［21］相一致. 本研究运用NAA及6-BA两种激素进行不同浓度配比，筛选出杂交构树愈伤诱导效果最好的激素浓度和配比，可以为今后的杂交构树叶片乃至茎段、根部愈伤组织培养提供一定的技术支持.