基于EPG的三种刺吸式害虫在苹果苗上的取食行为比较

周 昊,李 钰,滕子文,杜凌君,万方浩,2,周洪旭,*

(1.青岛农业大学植物医学学院,山东省植物病虫害综合防控实验室,中澳农业与环境健康联合研究院,山东青岛 266109; 2.中国农业科学院深圳农业基因研究所,广东深圳 518120)

苹果绵蚜Eriosomalanigerum(瘿绵蚜科Pemphigidae)、绣线菊蚜Aphiscitricola(蚜科Aphididae)和梨网蝽Stephanitisnashi(网蝽科Tingidae)是苹果园中的刺吸式害虫，它们都以刺吸式口器对苹果树造成不同程度的危害。苹果绵蚜刺吸苹果树的枝条、树干和根系，不为害叶片，能够向苹果树表皮组织中分泌唾液，使被害组织非正常性增生肿胀，影响水分及养分的运输，削弱树势。形成的肿瘤经常会破裂，形成伤口，有利于各种病菌滋生，导致木质部黑褐色坏死，被害根须根停止生长，丧失吸收能力，进一步腐烂，影响成花、成果，严重时导致整株死亡(Weber and Brown,1988;Kelmetal.,2004;Suetal.,2016)。绣线菊蚜主要群集在苹果树嫩梢、叶片背面，刺吸韧皮部汁液，影响新梢正常生长，严重时造成树势衰弱。绣线菊蚜在刺吸为害过程中能传播植物病毒，同时分泌的蜜露可覆盖苹果树叶片表面，利于病原菌的大量滋生，间接造成病害流行(殷万东等,2013)。梨网蝽主要在植物叶片背面刺食叶片细胞，造成叶片失绿正面出现黄白色斑点，降低光合作用，严重时造成叶片脱落，影响果树正常生长，降低果实产量和品质。同时，梨冠网蝽成、若虫在叶片背面排泄大量的黑褐色分泌物，污染下部叶片，利于病原菌的大量滋生，间接造成病害流行(孙学海,2007)。

植食性昆虫为了适应和突破植物的防御性状，在漫长的进化中形态逐渐发生变异，分化出不同类型的口器，如刺吸式、咀嚼式以及锉吸式口器等(Hermsmeieretal.,2001)。其中，刺吸式口器害虫种类繁多，具有繁殖数量大、繁殖速度快和发生世代数多等特点。该类昆虫不仅直接刺吸作物，影响作物正常生长，还能直接或间接传播病害。刺吸式口器昆虫可分为两大类：以蚜虫、粉虱等为代表的维管束汁液取食昆虫(vascular feeder)，该类昆虫取食植物时将口针刺入植物组织表皮细胞和薄壁细胞间，吸取木质部和(或)韧皮部的汁液(Tjallingii,2006)；另一类以蝽等为代表的叶肉细胞取食昆虫(mesophyll feeder)，这类昆虫取食时，先将口针刺穿植物表皮，然后插入植物细胞内或细胞间，然后通过口针的剧烈活动破坏植物细胞结构，并取食植物细胞的细胞质和细胞核(Southwood,1973;Labandeira and Phillips,1996)。

刺吸电位(electrical penetration graph,EPG)技术可以显示刺吸式昆虫的口针在植物内的不同部位以及昆虫的刺探和吸食行为。该技术具有操作周期短、灵敏快捷等优点，它最大的优越性在于能够准确记录昆虫的口针在植物组织内的每一种行为的起止时间及发生频次，如细胞穿刺、唾液分泌、韧皮部吸食、木质部吸食和口针的机械运动等。目前，该技术所涉及的昆虫种类包括蚜虫、粉虱、飞虱、介壳虫、蓟马、木虱、叶蝉等(李静静等,2019)，主要用于研究刺吸式口器昆虫对寄主植物的取食选择性、传毒机制、作物的抗虫机制等，是农业昆虫行为生态学研究中不可缺少的一个环节(姜永幸和郭予元,1994;闫凤鸣和王满囷,2017)。

苹果绵蚜和绣线菊蚜为汁液取食者，而梨网蝽为细胞取食者，同时苹果绵蚜在枝条上取食，而绣线菊蚜和梨网蝽取食叶片。因此本研究选取苹果园中具有代表性的这3种刺吸式害虫，利用EPG 分析其刺吸为害苹果树的刺吸电位波形，并与其取食的生物学意义相结合，揭示不同刺吸式口器昆虫取食的异同点，有助于阐明其生态位分离机制以及取食行为学机制，对于有效防治苹果园中刺吸式害虫具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 供试植物

供试苹果品种为长势相近的1年生新红星，由山东省烟台市栖霞苗圃提供，移栽至塑料花盆中，在玻璃温室中培养(25±3℃,RH 70%±10%，自然光照)至株高60～70 cm。每株苹果苗只测试1头昆虫，测试过EPG的苹果苗将不再继续试验。

1.2 供试昆虫

试验用苹果绵蚜、绣线菊蚜和梨网蝽采自青岛农业大学玻璃温室(25±3℃,RH 70%±10%，自然光照)内的1-2年生苹果苗上，未施用任何杀虫剂。选取长势相同虫体完整的成虫进行测定，测试过EPG的成虫将不再用于其他试验。

1.3 EPG波形记录

在显微镜下检查3种昆虫的成虫，以确保它们的口器和触角没有受损并用毛笔把苹果绵蚜体表的白色蜡泌物清理干净。使用Giga-8dd DC-EPG (输入抵抗：1 GΩ；数模转换器：100 Hz/14位分辨率) 系统(荷兰瓦赫宁根大学)记录3种昆虫的刺探电位图谱。为屏蔽外界环境的电磁干扰，取食试验分别在法拉第笼中(长×宽×高=80 cm×60 cm×100 cm)进行。将测试昆虫放置在冰袋上，将直径18 μm、长3～4 cm的金丝用导电银胶粘在供试昆虫的前胸背板上，金丝另一端用导电银胶粘在铜丝端(铜丝和铜钉通过锡焊接)。将粘连好的昆虫饥饿1 h，然后将铜钉插在EPG电极上，将粘在金丝上的苹果绵蚜放置在苹果嫩梢。用细胶带将叶片背面朝上，并使叶片保持完整，将绣线菊蚜和梨网蝽放置在叶片背面进行试验。随后，将长约10 cm的铜质棒状植物电极插入苹果盆栽土壤中。所有试验均在安静的室内进行(25±3℃，RH 50%±10%，人工光源1 000 lx)。当蚜虫的探针刺穿植物的组织时，电路闭合并放大，然后转换为数字信号，并通过Giga-8d控制单元进行放大，将其存储在计算机中。然后，该数字信号被转换为波形，并使用Stylet+d软件显示在屏幕上。每种昆虫试验数据记录15次，每次试验记录8 h。在记录的8 h内未显示取食波或无波形的昆虫不记录在数据中。记录结束后，使用Stylet+a软件根据Sandanayaka与Hale(2003)和何应琴(2015)的标准，将蚜虫的EPG波形划分为非刺探波(np)、路径波(C)、非主动细胞内取食波(pd)、木质部取食波(G)、韧皮部唾液分泌波(E1)、韧皮部取食波(E2)。根据前人研究及对比，将梨网蝽的EPG 波形划分为非刺探波(np)、刺探波(A)，口针在叶肉组织中的刺探和吸食波形(Gc)和木质部取食波形(E) (蔡晓明等,2008;赵秋剑等,2011;张琼,2017)。并对8 h波形进行区分标注，得到包含波形代码的数据文件，然后计算EPG指标。

1.4 数据分析

利用SPSS19.0 软件对苹果绵蚜和绣线菊蚜在苹果苗非韧皮部的各种EPG指标的差异进行独立样本T检验;利用Microsoft Excel 2010和SPSS19.0软件对梨网蝽、苹果绵蚜、绣线菊蚜3种害虫在苹果韧皮部的刺探次数、第1次刺探时间、np波总时间(s)的差异进行单因素方差分析，其均值差异采用最小显著差异法(LSD)检验。

2 结果

2.1 苹果绵蚜和绣线菊蚜成蚜取食行为比较

表1结果表明，两种蚜虫成蚜在苹果苗非韧皮部取食时，绣线菊蚜的刺探次数、np波总时间和pd波次数均显著高于苹果绵蚜，而苹果绵蚜的pd波平均时间显著高于绣线菊蚜的(P<0.05)，其他EPG指标(第1次开始刺探、C波总时间、G 波总时间和pd波总时间)无显著性差异(P>0.05)。

表1 苹果绵蚜和绣线菊蚜成蚜在苹果苗非韧皮部的EPG指标的比较Table 1 Comparison of EPG parameters of Eriosoma lanigerum and Aphis citricola adults in the non-phloem of apple seedlings

表2表明，苹果绵蚜和绣线菊蚜分别有56.25%和70.00%的蚜虫第1次到达韧皮部即能持续吸食。同时苹果绵蚜第1次出现E2波的时间显著高于绣线菊蚜的，而苹果绵蚜第1次到达韧皮部所用时间虽然没有显著高于绣线菊蚜的(P=0.055)，但其所用时间高于绣线菊蚜的，其他与韧皮部取食相关指标没有显著性差异(P>0.05)。

表2 苹果绵蚜和绣线菊蚜成蚜在苹果苗韧皮部的EPG指标的比较Table 2 Comparison of EPG parameters of Eriosoma lanigerum and Aphis citricola adults in the phloem of apple seedlings

2.2 梨网蝽、苹果绵蚜和绣线菊蚜成虫刺吸行为比较

表3表明梨网蝽取食苹果苗产生4种波形(np波、A波、Gc波和E波)，其np波总时间显著高于苹果绵蚜和绣线菊蚜的(P<0.05)。苹果绵蚜的第1次刺探时间显著高于绣线菊蚜和梨网蝽的(P<0.05)。

表3 梨网蝽、苹果绵蚜和绣线菊蚜成虫在苹果苗上取食行为的比较Table 3 Comparison of feeding behaviors of Stephanitis nashi，Eriosoma lanigerum and Aphis citricola adults on apple seedlings

2.3 苹果绵蚜、绣线菊蚜和梨网蝽成虫产生波形的比重分析

统计3种刺吸式口器昆虫在苹果苗取食时各波形所占比例，做出波形比重分析图，图1表明，梨网蝽的np波总时间最长(53%)，其次是绣线菊蚜的(24%)，苹果绵蚜的最低(1%)。从两个汁液取食者(vascular feeder)的C波所占比例来看，苹果绵蚜的C波占取食时间的51%,明显高于绣线菊蚜的37%，而np波的持续时间为1%，远远低于绣线菊蚜的24%和梨网蝽的53%。苹果绵蚜花费5%的时间在木质部取食(G波)，而绣线菊蚜则花费8%的时间在木质部取食。苹果绵蚜和绣线菊蚜在苹果苗上取食时,E2波(在韧皮部取食)所占总时间比例分别为35%和25%，而梨网蝽的取食波为Gc波(植物细胞取食，占总时间比例为36%)和E波(韧皮部取食，占总时间比例为11%)。

图1 苹果绵蚜、绣线菊蚜和梨网蝽成虫在苹果苗上取食8 h各种波形平均持续时间的占比Fig.1 Proportions of duration of various waveforms of Eriosoma lanigerum,Aphis citricola and Stephanitis nashi adults feeding on apple seedlings for 8 h

3 讨论

3.1 苹果绵蚜、绣线菊蚜与梨网蝽的取食行为的比较

EPG技术是研究刺吸式害虫取食行为不可缺少的一个重要环节，随着科学技术的发展，EPG技术也越来越完善，蚜虫、粉虱、蓟马、盲蝽和叶蝉等昆虫的各个EPG波形生物学意义也相继得到了明确阐述(Kimmins and Tjallingii,1985;罗晨等,2005)。由于刺吸式口器昆虫与寄主植物的对应关系较复杂，因此不断有新的波形被发现和描述，其结果均证实EPG波形不仅具有稳定性，同时也有其多样性(罗晨等,2005)。本研究运用EPG技术对苹果园中的3种刺吸式昆虫试验发现，苹果绵蚜和绣线菊蚜这两种汁液取食者均能产生np波、C波、pd波、G波、E1波和E2波6种主要取食波形，且波形形状和其代表的生物学意义基本相同(表1)。张琼(2017)利用EPG技术对华南冠网蝽Stephanitislaudata和杜鹃冠网蝽S.pyrioides在杜鹃上取食行为进行试验分析，发现两种网蝽科害虫的波形大致相同，分为np波、A波、G波、E1波和E2波。

而本研究发现梨网蝽在苹果上取食的波形(表2)与张琼(2017)发现的波形大体一致。同时张琼(2017)中网蝽E1和E2波形的频率特征非常相似，可以表明网蝽E1和E2其实是一类波形的不同变型。梨网蝽是细胞取食者，为区分与蚜虫波形命名，遂将梨网蝽波形命名为np波、A波、Gc波和E波4种波形。我们将蚜虫和梨网蝽的波形并结合前人研究进行比较发现(蔡晓明等,2008;赵秋剑等,2011;张琼,2017)，蚜虫的G波与梨网蝽的E波的特征大体一致，因为G波为蚜虫吸食木质部水分的波形，所以我们推测E波为木质部取食波形，今后可结合透射电镜、同位素示踪、口针切割等技术，对上述波形进行验证。

经过以上对比分析苹果绵蚜、绣线菊蚜和梨网蝽的EPG取食波谱及其特征，我们发现，这3种刺吸式昆虫均经历了口针未进行刺探-口针进入植物组织刺探-口针到达取食部位进行取食的过程，而对应的波形则是按照非刺探波(np)-路径波(A,C和pd)-吸食波(Gc,E1,E2,G和E)依次发生(表1～3)。苹果绵蚜、绣线菊蚜和梨网蝽的非刺探波都为np波，苹果绵蚜和绣线菊蚜这类汁液取食者需要刺破表皮，并通过细胞间隙到达韧皮部，所以蚜虫的路径波为C波和pd波，而梨网蝽为细胞取食者只需刺破植物表皮就可取食植物细胞，所以其路径波A波总时间很短，一般为1～5 s。苹果绵蚜和绣线菊蚜取食波为E1与E2波(韧皮部取食波)和G波(木质部吸食水分波)，而梨网蝽取食波为Gc波(口针在叶肉组织中的刺探和吸食波形)、E波木质部取食波形。

植食性刺吸式昆虫接触寄主植物时，会首先对寄主植物的表面进行识别和判断，确定是否符合刺探取食的要求(刘向东等,2004)。从本次试验可以看出苹果绵蚜第1次开始刺探的时间长于绣线菊蚜和梨网蝽，苹果绵蚜需要更长的时间对寄主植物的表面物质进行识别(表3)。有研究表明，植物表面的结构、蜡质和挥发物等能直接和间接地影响植食性昆虫的取食行为(阎凤鸣,2000;王美芳等,2009)。我们推测，因为苹果绵蚜是取食苹果枝条的刺吸式昆虫，绣线菊蚜和梨网蝽为取食植物叶片的刺吸式昆虫，叶片相对于主干更容易找到适宜取食位点，因此苹果绵蚜第一次开始刺探的时间较长，要花费较长时间寻找适合的取食位点。

从np波总时间和刺探次数来看，苹果绵蚜的指标显著小于绣线菊蚜和梨网蝽(表3)，苹果绵蚜一旦确定适宜的刺吸位点就进行长期取食，很少移动更换取食位点，而绣线菊蚜和梨网蝽则经常更换取食位点，这是可能是因为绣线菊蚜和梨网蝽刺吸叶片后，该区域的营养不支持绣线菊蚜和梨网蝽继续取食，因此它们为了获得更好的营养，经常转移为害其他叶片，更换取食位点。与叶片相比，枝条被苹果绵蚜刺吸为害后，其组织结构和营养来源比较稳定，所以苹果绵蚜一旦固定在枝条上刺吸为害后，就很少移动，更换取食位点。因此，我们推测寄主植物被取食部位的营养变动情况，是影响刺吸式昆虫取食效率行为的一个重要因素。

蚜虫角质层柔嫩，易脱水死亡，所以对木质部水分的吸收可能是恢复和维持蚜虫水分平衡的一种常见和有效的方法。本研究发现苹果绵蚜花费5%的时间在木质部取食，而绣线菊蚜则花费8%的取食时间在木质部(图1)，说明绣线菊蚜相对于苹果绵蚜更需要水分，这可能与苹果绵蚜体表有较厚的蜡泌物覆盖，减少水分散失有关。蚜虫除了吸收水分外，还需要充足的营养物质，它们在韧皮部取食会产生E1(分泌可溶性唾液)和E2波(被动取食汁液)这两种波形。从本研究中两种蚜虫的韧皮部EPG指标来看，除第1次出现E2波外，其他各指标没有显著差异(表1)。但苹果绵蚜的E2波占总时间比例(35%)比绣线菊蚜的E2波占总时间比例(25%)多(图1)，说明苹果绵蚜相对绣线菊蚜更需要营养。梨网蝽作为细胞取食者，其取食波为Gc波(植物细胞取食)和E波(韧皮部取食)，分别占取食行为总时间的36%和11%(图1)。昆虫摄取的营养除了需满足自身正常的生长发育外，还需促使其产生正常的取食活动(殷万东等,2013)，网蝽的体型和活动量均大于蚜虫所以要用近一半的时间进行取食营养，以支持其取食活动。

3.2 取食行为与传毒的关系

绝大多数的植物病毒依赖于媒介昆虫进行传播，而昆虫取食行为则是病毒传播的一个重要环节。刺吸式口器昆虫占传毒昆虫的92%以上，仅蚜虫传播的植物病毒就有13个属约316个种 (韦石泉,1991;Candiceetal.,2012)。蚜虫口针一般通过短暂地刺吸表皮细胞来获取病毒，最初的刺吸可获取半持久性病毒。而蚜虫的获毒效率与pd波次数呈正相关(张鹏飞等,2001;王斌等,2003)。同时当介体昆虫获毒后，介体昆虫在植物上的滞留时间越短，就越有利于病毒的传播(Palaciosetal.,2002;施艳等,2013)。绣线菊蚜可以传播植物病毒，而未见苹果绵蚜能传播植物病毒的报道(李尉民和濮祖芹,1991;周彦等,2015)。通过苹果绵蚜和绣线菊蚜的EPG指标，我们发现苹果绵蚜的pd波次数和刺探次数也都显著低于绣线菊蚜，说明苹果绵蚜的口针刺穿植物细胞的频率很低，同时又在同一刺吸位点滞留时间很长，很难使病毒相对快速地在植物体内和种间传播，这在某种程度上解释了苹果绵蚜未见传播病毒的现象。

综上所述，我们发现蚜虫类汁液取食者的波EPG波形和生物学意义基本一致，不会因其取食部位不同而改变。同时，本研究还发现绣线菊蚜和梨网蝽这类叶片取食者会频繁地更改取食位点，而苹果绵蚜这种枝条取食者一旦确定取食位点就基本不会改变。因此，我们推测寄主植物被取食部位的营养变动情况，是影响刺吸式昆虫取食效率行为的一个重要因素。本研究阐释了苹果园刺吸式口器害虫的生态位分离机制以及取食行为学机制，为果园刺吸式口器害虫的综合治理提供了理论依据。